Разработка HiPSC-продуцированных сывороточных свободных эмбриоидных тел для опроса трехмерных культур стволовых клеток с использованием физиологически релевантных анализов

Общая цель этого протокола для 3D человеческих iPSC-эмбриоидных тел состоит в том, чтобы создать систему in vitro, которая приближается к раннему развитию коры головного мозга человека, что может быть использовано для разработки лекарств. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток, такие как как как нейроны происходят от ИПСК и формируют функциональные сети в 3D-тканях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет нам моделировать аспекты развития коры головного мозга в чашке, из человеческой ткани, содержащей генетику больных людей, таким образом, система служит клеточной платформой для скрининга лекарств, которая является масштабируемой и может быть использована для изучения многих различных нейробиологических расстройств.

Хотя этот метод может дать представление о нейробиологических нарушениях или нарушениях нейроразвития, он также может быть применен к другим системам, например, тем, которые сосредоточены на моделях нейроиммунной функции или нейронной информации. Для этого протокола начните с создания фетальных клеток. Чтобы создать эту культуру, поместите 600 000 фетальных клеток в каждую лунку шестилуночного планшета, по 300 миллилитров среды в лунку.

После культивирования клеток плода в течение 48 часов замените среду. Инкубируйте планшеты в течение часа, одновременно подготавливая стволовые клетки. Разморозьте стволовые клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

После размораживания переложите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и заполните пробирку до пяти миллилитров питательной средой, добавленной по каплям. Далее аккуратно центрифугируют клетки в течение четырех минут, аспирируют надосадочную жидкость и аккуратно повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре среды стволовых клеток с ингибитором ROCK. После количественного определения плотности клеток поместите 300 000 стволовых клеток на питающие клетки.

Затем выращивают и размножают культуры, периодически отбирая здоровые клетки, после размножения и замораживая клетки для резервных. Выращивайте колонии стволовых клеток на стандартных планшетах до тех пор, пока они не достигнут 50–70% конфлюенции. Затем используйте мягкое ферментативное лечение и мягкое растирание с помощью одного миллилитра пипетки, чтобы собрать ИПСК для дифференцировки клеток-предшественников нейро

Аккуратно центрифугируйте суспензию, отасуньте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах среды iPSC человека. Затем перенесите клеточную суспензию в пятисантиметровую чашку для клеточной культуры, покрытую 0,1% желатином, и инкубируйте планшет в течение одного часа. Через час перенесите неадгезивные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Затем аккуратно промойте тарелку тремя миллилитрами среды и переложите ее в ту же пробирку. Затем повторите этап повторного суспендирования с щадящим центрифугированием, затем определите плотность ячеек и поместите элементы в 96-луночную V-образную пластину с низкой адгезией при концентрации 9 000 ячеек на лунку. Теперь покрутите пластину в течение трех минут и начните культивировать клетки.

В течение следующих 14 дней через день заменяйте половину среды на свежую дифференцирующую среднюю. После двух недель культивирования клеток приготовьте шесть луночных планшетов со вставками для клеточных культур размером 40 микрон и одним миллилитром среды DM1. Инкубируйте эти планшеты не менее четырех часов перед добавлением культивируемых клеток.

Затем с помощью наконечника для пипетки с широким горлышком объемом 200 микролитров соберите двухнедельные клеточные агрегаты объемом около 20 микролитров среды. Перенесите от четырех до шести агрегатов на каждую вставку, с минимальным раствором, удалите излишки. На этом этапе важно работать быстро и твердой рукой, при удалении среды вокруг SFEB вы можете увидеть, как SFEB перемещаются по раствору из-за поверхностного натяжения.

После удаления носителя их можно переместить на место. После того, как все агрегаты загружены во вкладыши, смените среду на один миллилитр DM2 и продолжайте культивировать клетки через день. Замените три четверти среды свежей средой.

После 14 дней культивирования начните добавлять среду DM3 в культуры. Продолжайте культивацию еще 16 дней, чтобы вырастить SFEBs. Теперь аккуратно отсоедините SFEB от вкладыша с помощью наконечника пипетки с широким горлышком объемом 200 микролитров.

Переложите SFEB на 12-луночные планшеты, загружая от четырех до восьми на лунку. Затем окрасьте их в контур в текстовом протоколе. Чтобы подготовить 12 колодцев и восемь пластин, сначала трижды промойте их стерильной водой.

Затем промойте их один раз с использованием 75% этанола и еще раз со 100% этанолом. Затем выпекайте тарелки при температуре 50 градусов Цельсия в течение четырех-пяти часов вверх ногами, чтобы завершить процесс стерилизации. После запекания добавьте в каждую лунку по 500 микролитров 0,2% раствора PEI и дайте тарелке постоять при комнатной температуре в течение часа.

Затем аспирируйте PEI и четыре раза промойте лунки стерильной дистиллированной водой и высушите их на воздухе в течение ночи. На следующий день приготовьте свежий ламинант в среде L15 и добавьте по 10 микролитров в центр каждой лунки. Затем добавьте дистиллированную воду в окружающие резервуары, чтобы предотвратить испарение, и выдержите тарелку в течение часа при температуре 37 градусов по Цельсию.

Обязательно направляйте ламинант в центр электродов, стараясь не выходить за пределы пространства заземляющих электродов, если это пространство будет превышено, нейроны будут расти над заземляющими электродами, вызывая шумовые артефакты и влияя на точность записи. Теперь добавьте по одному подготовленному SFEB в каждую лунку, используя мягкое отсасывание с помощью пипетки с широким отверстием. Затем добавьте по 200 микролитров DM2 в каждую лунку и закваливайте тарелку на ночь.

Позже, чтобы записать нейронную активность, вставьте пластину в считыватель пластин. Разогрейте его до 37 градусов по Цельсию. Затем с помощью программного обеспечения запишите 10 минут активности из каждой скважины.

SFEB выращивают с использованием описанного метода, получают ткань с морфологическими характеристиками, напоминающими раннюю развивающуюся кортикальную субжелудочковую зону, изобилующую обширными положительными нейронами Tuj1, а также нейропредшественниками. Многочисленные развивающиеся корковые розетки наблюдались во внешних слоях и во внутренних слоях тел. Внешний край тел напоминает развивающуюся кортикальную пластинку, содержащую постмитотические нейроны, что подтверждается экспрессией Brn2, маркера нейропредшественников и наиболее вентрализованных наружных слоев коры.

Внешние слои также содержат Рилин-положительные клетки, которые могут быть случайными клетками гратцеля или их предшественниками. Тела также экспрессировали маркеры, согласующиеся со смешанным происхождением кодала и медиального ганглионарного происхождения. Основано на экспрессии приготовленных маркеров TF2 и Nkx2.1.

Культивируемые SFEBs дают как CalR, так и CalB положительные интернейроны. А также VGLUT положительные возбуждающие нейроны и Tbr1 положительные глутаматергические нейронные предшественники. В соответствии с другими отчетами, 61% клеток тел были VGLUT-положительными, а 43% — Tbr1-положительными.

Записи MEM, сделанные с тел, могут быть сделаны в течение длительных периодов времени, и записи показали развитие разрыва на уровне корковой сети. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выращивать SFEBs из iPSCs человека, характеризовать содержание нейрулы в карательных развивающихся корковых розетках с NSFEBs. и проводить нейрофизиологические анализы созревающих SFEB.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что требуется время и практика для разработки необходимой научной области для изучения поведения ИПСК и ИПСК для проникновения нейронов в культуру. Культивируемые клетки должны контролироваться ежедневно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как визуализация кальция, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как медикаментозное лечение может повлиять на колебания корковой сети.