Неинвазивный выборки слизистую жидкость для количественной оценки в Vivo иммунной посредника уровня верхних дыхательных путей
7 августа 2017 г.
Этот протокол описывает неинвазивным методом отбора проб ненарушенных слизистую жидкость из верхних дыхательных путей. Он может использоваться для выполнения количественная оценка в естественных условиях уровни белка посредников, таких как цитокинов и chemokines, в субъектах всех возрастов.
Общая цель этого метода отбора проб жидкости слизистой оболочки заключается в изучении местной иммунной сигнатуры дыхательных путей без необходимости проведения стимулирующих процедур. Этот метод позволяет изучить ключевые вопросы в области детских респираторных заболеваний, таких как инфекции, астма и аллергия. Преимущества метода заключаются в том, что вы можете измерить очень низкий уровень иммунных медиаторов в нестимулированной слизистой оболочке дыхательных путей in vivo.
Демонстрацию процедуры проведет доктор Вольск. Для сбора образцов новорожденных сначала вырежьте не менее двух полосок размером три на 15 миллиметров из волокнистых фильтрующих листов из гидроксилированного полиэстера. Затем положите новорожденного на кровать и обратите внимание на любые симптомы инфекции дыхательных путей.
Затем с помощью щипцов вставьте один лист фильтровальной бумаги примерно на один сантиметр в переднюю часть нижней носовой раковины каждой ноздри младенца и при необходимости дайте новорожденному сахарную воду для комфорта. Обратите внимание на любое чихание, постоянный плач или носовое кровотечение, которые возникают в период отбора проб. После двух минут впитывания переложите фильтровальную бумагу в пробирку с этикеткой для немедленного хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Демонстрировать экспериментальную процедуру будет Лисбет Росхольм, техник в моей лаборатории. Для количественного определения иммунного медиатора дыхательных путей поместите на лед до 10 образцов из хранилища с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия и запишите их идентификационные номера. Когда образцы оттают, погрузите обе фильтровальные бумаги для каждого субъекта в 150 микролитров свежеприготовленного буфера на фильтровальную бумагу, добавив одну полную таблетку ингибитора протеазы на 25 миллилитров буферного исходного раствора.
Переложите образцы в шейкер для тарелок со скоростью 400 об/мин на пять минут. Переложите буферную и фильтровальную бумагу в чашки отдельных трубчатых фильтров из ацетата целлюлозы. Центрифугируйте образцы, чтобы собрать отфильтрованный назальный экстракт на дно микроцентрифужных пробирок.
Затем снимите чашки и положите трубочки на лед. Затем перелейте 150 микролитров аликвот назального экстракта в отдельные лунки с пластинами для хранения с низким содержанием белка и храните пластины при температуре минус 80 градусов Цельсия до анализа. Затем измерьте концентрацию представляющих интерес назальных иммунных медиаторов с помощью высокочувствительной мультиплексной матрицы на основе электрохемилюминесценции в соответствии со стандартными протоколами анализа.
В этом репрезентативном анализе 620 новорожденных большинство измеренных иммунных медиаторов продемонстрировали низкий уровень обнаружения. Уровни гамма-излучения ИФН были ниже нижнего предела обнаружения почти в половине образцов, в то время как уровни альфа, CCL4 и TGF бета ФНО были ниже нижнего предела обнаружения менее чем в 1% образцов. Сильная мультиколлинеарность была очевидна для 20 обнаруженных уровней медиаторов, что проиллюстрировано тепловой картой.
У новорожденных, инфицированных бессимптомным пикорнавирусом, наблюдался повышенный профиль, скомпрометированный в основном иммунными медиаторами 1 типа, что свидетельствует об иммунотриггерной роли колонизирующих бактерий и вирусов на ранних этапах жизни. Также была определена связь между присутствием братьев и сестер в домохозяйстве при рождении и специфическим направленным иммунным ответом слизистых оболочек типа 1 типа 17 с доказательствами корреляции этого явления с эффектом иммунопрайминга in utero, который обратно коррелирует со временем, прошедшим с момента последних родов. Кроме того, дети, рожденные от матерей, получавших добавки в высоком дозе по сравнению с плацебо, характеризовались повышением регуляции специфических иммунных медиаторов, что позволяет предположить, что витамин D способствует антибактериальному иммунному ответу, независимому от того, который вызван вирусом, бактериями, братьями и сестрами или материнской атопией.
Этот метод микровыборки также может быть использован через бронхоскоп, что позволяет изучить иммунные медиаторы в нижних дыхательных путях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять медиаторы в нестимулированной слизистой оболочке дыхательных путей in vivo у новорожденных и детей старшего возраста.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол описывает неинвазивную методику для отбора невооруженной слизистой выстилки жидкости из верхних дыхательных путей. Он позволяет проводить количественный анализ уровней белковых медиаторов, таких как цитокины и хемокины, у субъектов всех возрастных групп.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Респираторные заболевания
- Иммунология
- Педиатрия
Предыстория
- Этот метод изучает локальную иммунную сигнатуру дыхательных путей без стимуляционных процедур.
- Он применим к педиатрическим респираторным заболеваниям, таким как инфекции, астма и аллергия.
- Техника позволяет измерять низкие уровни иммунных медиаторов в нестимулированной слизистой оболочке дыхательных путей in vivo.
- Демонстрация процедуры проводится д-ром Вольском.
Цель исследования
- Исследовать иммунный ответ в слизистой оболочке дыхательных путей.
- Предоставить представление о педиатрических респираторных состояниях.
- Способствовать неинвазивным методикам отбора образцов для исследования.
Используемые методы
- Сбор слизистой выстилки жидкости из верхних дыхательных путей.
- Использование фиброзных гидроксильных полиэфирных фильтров для сбора образцов.
- Наблюдение за симптомами инфекции дыхательных путей у новорожденных.
- Количественный анализ цитокинов и хемокинов в собранных образцах.
Основные результаты
- Успешный сбор слизистой выстилки без инвазивных процедур.
- Возможность измерения иммунных медиаторов in vivo.
- Взгляды на иммунный профиль педиатрических пациентов.
- Потенциальные применения в понимании респираторных заболеваний.
Выводы
- Неинвазивный метод отбора образцов эффективен для исследования иммунитета дыхательных путей.
- Эта техника может улучшить исследования в области педиатрического респираторного здоровья.
- Будущие исследования могут расширить находки, связанные с иммунными медиаторами.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This noninvasive mucosal lining fluid sampling method enables direct quantification of in vivo immune mediators in the upper airway mucosa without stimulation, providing a physiologically relevant readout of airway immune activity. The technique supports early-life immune profiling and longitudinal monitoring, facilitating mechanistic de-risking in respiratory therapeutic development by linking genetic and environmental exposures to immune phenotypes. Its application in neonatal and pediatric cohorts offers predictive value for endotyping and monitoring disease progression, particularly in asthma, allergy, and infectious disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring baseline and induced levels of immune mediators in unstimulated mucosal tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible, minimally invasive matrix for functional target validation in pediatric populations.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through correlation of mediator profiles with clinical phenotypes such as asymptomatic viral infection and sibling exposure effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates eluted protein samples compatible with high-sensitivity electrochemiluminescence multiplex arrays for quantitative immune profiling.
- Standardization: Uses consistent filter paper absorption and elution protocols to ensure reproducible recovery of analytes across subjects and timepoints.
- Scalability: Demonstrated feasibility in large neonatal cohorts (n=620), supporting high-throughput screening applications in epidemiologic and interventional studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal sampling from birth through childhood, linking early-life immune signatures to later respiratory disease outcomes.
- Biomarker Alignment: Detects upregulation of type 1 and type 17 immune mediators in asymptomatic picornavirus-infected neonates, suggesting utility in identifying immune endotypes.
- Mechanistic De-risking: Reveals associations between maternal vitamin D supplementation and antibacterial immune responses, supporting target prioritization for immunomodulatory interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase by enabling direct measurement of immune mediators in vivo, informing target selection and pathway elucidation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune pathway activation in mucosal tissue without ex vivo manipulation or stimulation artifacts.
- Screening: Produces standardized eluates suitable for multiplex immunoassay readouts, facilitating comparative analysis across treatment or exposure groups.
- Analytics: Generates quantitative mediator levels that allow statistical assessment of collinearity, immune network activity, and phenotype associations.
- Translational Research: Connects neonatal immune profiles to childhood respiratory symptoms and environmental exposures, supporting risk-stratified advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-compatible sampling technique applicable across respiratory disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by capturing endogenous immune activity in the native mucosal microenvironment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized collection, elution, and storage procedures, minimizing pre-analytical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immunomodulatory mechanisms to early-life immune signatures, reducing late-stage biological risk in respiratory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on demonstrated effects on mucosal immune pathways in relevant, longitudinal human models.
Implementation Considerations
- Requires training in neonatal airway anatomy and gentle sampling technique to ensure subject comfort and sample integrity.
- Dependent on access to ultrafilter tubes, plate shakers, and electrochemiluminescence immunoassay infrastructure for analyte detection.
- Necessitates standardized buffer preparation with protease inhibitors to prevent mediator degradation during extraction.
- Requires adaptation of sampling duration or filter size when applied to older children or alternative mucosal sites.
- Limited by analyte abundance, with some mediators frequently below detection limit, necessitating assay sensitivity optimization for low-expression targets.
