Неинвазивный выборки слизистую жидкость для количественной оценки в Vivo иммунной посредника уровня верхних дыхательных путей

Общая цель этого метода отбора проб жидкости слизистой оболочки заключается в изучении местной иммунной сигнатуры дыхательных путей без необходимости проведения стимулирующих процедур. Этот метод позволяет изучить ключевые вопросы в области детских респираторных заболеваний, таких как инфекции, астма и аллергия. Преимущества метода заключаются в том, что вы можете измерить очень низкий уровень иммунных медиаторов в нестимулированной слизистой оболочке дыхательных путей in vivo.

Демонстрацию процедуры проведет доктор Вольск. Для сбора образцов новорожденных сначала вырежьте не менее двух полосок размером три на 15 миллиметров из волокнистых фильтрующих листов из гидроксилированного полиэстера. Затем положите новорожденного на кровать и обратите внимание на любые симптомы инфекции дыхательных путей.

Затем с помощью щипцов вставьте один лист фильтровальной бумаги примерно на один сантиметр в переднюю часть нижней носовой раковины каждой ноздри младенца и при необходимости дайте новорожденному сахарную воду для комфорта. Обратите внимание на любое чихание, постоянный плач или носовое кровотечение, которые возникают в период отбора проб. После двух минут впитывания переложите фильтровальную бумагу в пробирку с этикеткой для немедленного хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Демонстрировать экспериментальную процедуру будет Лисбет Росхольм, техник в моей лаборатории. Для количественного определения иммунного медиатора дыхательных путей поместите на лед до 10 образцов из хранилища с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия и запишите их идентификационные номера. Когда образцы оттают, погрузите обе фильтровальные бумаги для каждого субъекта в 150 микролитров свежеприготовленного буфера на фильтровальную бумагу, добавив одну полную таблетку ингибитора протеазы на 25 миллилитров буферного исходного раствора.

Переложите образцы в шейкер для тарелок со скоростью 400 об/мин на пять минут. Переложите буферную и фильтровальную бумагу в чашки отдельных трубчатых фильтров из ацетата целлюлозы. Центрифугируйте образцы, чтобы собрать отфильтрованный назальный экстракт на дно микроцентрифужных пробирок.

Затем снимите чашки и положите трубочки на лед. Затем перелейте 150 микролитров аликвот назального экстракта в отдельные лунки с пластинами для хранения с низким содержанием белка и храните пластины при температуре минус 80 градусов Цельсия до анализа. Затем измерьте концентрацию представляющих интерес назальных иммунных медиаторов с помощью высокочувствительной мультиплексной матрицы на основе электрохемилюминесценции в соответствии со стандартными протоколами анализа.

В этом репрезентативном анализе 620 новорожденных большинство измеренных иммунных медиаторов продемонстрировали низкий уровень обнаружения. Уровни гамма-излучения ИФН были ниже нижнего предела обнаружения почти в половине образцов, в то время как уровни альфа, CCL4 и TGF бета ФНО были ниже нижнего предела обнаружения менее чем в 1% образцов. Сильная мультиколлинеарность была очевидна для 20 обнаруженных уровней медиаторов, что проиллюстрировано тепловой картой.

У новорожденных, инфицированных бессимптомным пикорнавирусом, наблюдался повышенный профиль, скомпрометированный в основном иммунными медиаторами 1 типа, что свидетельствует об иммунотриггерной роли колонизирующих бактерий и вирусов на ранних этапах жизни. Также была определена связь между присутствием братьев и сестер в домохозяйстве при рождении и специфическим направленным иммунным ответом слизистых оболочек типа 1 типа 17 с доказательствами корреляции этого явления с эффектом иммунопрайминга in utero, который обратно коррелирует со временем, прошедшим с момента последних родов. Кроме того, дети, рожденные от матерей, получавших добавки в высоком дозе по сравнению с плацебо, характеризовались повышением регуляции специфических иммунных медиаторов, что позволяет предположить, что витамин D способствует антибактериальному иммунному ответу, независимому от того, который вызван вирусом, бактериями, братьями и сестрами или материнской атопией.

Этот метод микровыборки также может быть использован через бронхоскоп, что позволяет изучить иммунные медиаторы в нижних дыхательных путях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять медиаторы в нестимулированной слизистой оболочке дыхательных путей in vivo у новорожденных и детей старшего возраста.