Неинвазивный выборки слизистую жидкость для количественной оценки в Vivo иммунной посредника уровня верхних дыхательных путей
7 августа 2017 г.
Этот протокол описывает неинвазивным методом отбора проб ненарушенных слизистую жидкость из верхних дыхательных путей. Он может использоваться для выполнения количественная оценка в естественных условиях уровни белка посредников, таких как цитокинов и chemokines, в субъектах всех возрастов.
Общая цель данного метода отбора проб жидкости слизистой оболочки заключается в изучении локального иммунного профиля дыхательных путей без необходимости проведения процедур стимуляции. Данный метод позволяет исследовать ключевые вопросы в области педиатрических респираторных заболеваний, таких как инфекции, астма и аллергия. Преимуществом метода является возможность измерения очень низких уровней иммунных медиаторов в нестимулированной слизистой оболочке дыхательных путей in vivo.
Процедуру продемонстрирует доктор Волск. Для сбора образцов новорожденных сначала вырежьте не менее двух полосок размером 3 x 15 мм из волокнистых гидроксилированных полиэфирных фильтрующих листов. Затем уложите новорожденного на кушетку и отметьте любые симптомы инфекции дыхательных путей.
Затем с помощью пинцета введите один кусочек фильтровальной бумаги примерно на один сантиметр в переднюю часть нижней носовой раковины каждой ноздри младенца и, при необходимости, дайте новорожденному сахарную воду для успокоения. Отмечайте любые случаи чихания, продолжительного плача или эпистаксиса, возникшие в период забора проб. После двух минут абсорбции перенесите фильтровальную бумагу в маркированную пробирку для немедленного хранения при температуре -80 °C.
Экспериментальную процедуру продемонстрирует Лисбет Росхолм, техник моей лаборатории. Для количественного определения иммунных медиаторов дыхательных путей поместите до 10 образцов из хранилища при -80 °C на лед и запишите их идентификационные номера. После размораживания образцов погрузите оба фильтрующих листа каждого субъекта в 150 µL свежеприготовленного буфера на один лист, дополненного одной полной таблеткой ингибитора протеаз на 25 mL исходного раствора буфера.
Перенесите образцы на шейкер для планшетов и перемешивайте при 400 rpm в течение пяти минут. Перенесите буфер и фильтровальную бумагу в стаканы индивидуальных трубчатых фильтров из ацетата целлюлозы. Центрифугируйте образцы, чтобы собрать отфильтрованный назальный экстракт на дне микроцентрифужных пробирок.
Затем извлеките стаканчики и поместите пробирки на лед. Далее перенесите аликвоты назального экстракта объемом 150 µL в отдельные лунки планшетов для хранения с низкой связывающей способностью к белкам и храните планшеты при температуре -80 °C до проведения анализа. Затем измерьте концентрацию интересующих назальных иммунных медиаторов с помощью высокочувствительного мультиплексного массива на основе электрохемилюминесценции в соответствии со стандартными протоколами анализа.
В данном репрезентативном анализе 620 новорожденных большинство измеряемых иммунных медиаторов находились на низком уровне обнаружения. Уровни IFN gamma были ниже нижнего предела обнаружения почти в половине образцов, в то время как уровни TNF alpha, CCL4 и TGF beta были ниже нижнего предела обнаружения менее чем в 1% образцов. Для 20 обнаруженных уровней медиаторов была выражена сильная мультиколлинеарность, что проиллюстрировано на тепловой карте.
У новорожденных с бессимптомной инфекцией пикорнавирусом наблюдался повышенный профиль, состоящий преимущественно из иммунных медиаторов 1-го типа, что указывает на роль колонизирующих бактерий и вирусов в запуске иммунного ответа в самый ранний период жизни. Также была выявлена связь между наличием братьев и сестер в семье при рождении и специфическим слизистым иммунным ответом 1-го и 17-го типов; при этом были получены данные о корреляции этого явления с эффектом внутриутробного иммунного прайминга, который обратно коррелирует с временем, прошедшим с момента последних родов. Кроме того, дети, рожденные матерями, получавшими высокие дозы добавок по сравнению с плацебо, характеризовались повышением уровня специфических иммунных медиаторов, что позволяет предположить, что витамин D способствует антибактериальному иммунному ответу независимо от воздействия вирусов, бактерий, наличия братьев и сестер или материнской атопии.
Данный метод микробиопсии также может быть использован с помощью бронхоскопа, что позволяет изучать иммунные медиаторы в нижних дыхательных путях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять уровень медиаторов в нестимулированной слизистой оболочке дыхательных путей in vivo у новорожденных и детей старшего возраста.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается неинвазивный метод забора ненарушенной жидкости слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Этот метод позволяет количественно определить уровни белковых медиаторов, таких как цитокины и хемокины, in vivo у субъектов любого возраста.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Респираторные заболевания
- Иммунология
- Педиатрия
Обзор
- Данный метод позволяет изучить локальный иммунный профиль дыхательных путей без применения процедур стимуляции.
- Он применим при детских респираторных заболеваниях, таких как инфекции, астма и аллергия.
- Этот метод позволяет измерять низкие уровни иммунных медиаторов в нестимулированной слизистой оболочке дыхательных путей in vivo.
- Демонстрация процедуры проводится доктором Волском.
Цель исследования
- Для изучения иммунного ответа в слизистой оболочке дыхательных путей.
- Для получения данных о респираторных заболеваниях у детей.
- Для внедрения методов неинвазивного забора проб в исследовательскую практику.
Используемые методы
- Сбор жидкости слизистой оболочки верхних дыхательных путей.
- Использование волокнистых гидроксилированных полиэфирных фильтрующих листов для сбора образцов.
- Наблюдение за симптомами инфекции дыхательных путей у новорожденных.
- Количественное определение цитокинов и хемокинов в собранных образцах.
Основные результаты
- Успешный сбор жидкости слизистой оболочки без проведения инвазивных процедур.
- Возможность измерения иммунных медиаторов in vivo.
- Данные об иммунном профиле пациентов детского возраста.
- Потенциальное применение для изучения респираторных заболеваний.
Выводы
- Неинвазивный метод отбора проб эффективен для изучения иммунитета дыхательных путей.
- Данный метод может способствовать развитию исследований здоровья органов дыхания у детей.
- Будущие исследования могут расширить данные о роли иммунных медиаторов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности и бизнеса
Этот неинвазивный метод забора жидкости с поверхности слизистой оболочки позволяет напрямую количественно определять иммунные медиаторы in vivo в слизистой верхних дыхательных путей без применения стимуляции, обеспечивая физиологически релевантную оценку иммунной активности дыхательных путей. Данная методика позволяет проводить иммунологическое профилирование на ранних этапах жизни и осуществлять лонгитюдный мониторинг, что способствует снижению механистических рисков при разработке респираторных терапевтических средств путем установления связи между генетическими и средовыми факторами и иммунными фенотипами. Ее применение в неонатальных и педиатрических когортах обладает прогностической ценностью для эндотипирования и мониторинга прогрессирования заболеваний, особенно в контексте астмы, аллергии и инфекционных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения базовых и индуцированных уровней иммунных медиаторов в нестимулированной слизистой ткани.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимый, минимально инвазивный матрикс для функциональной валидации мишеней в педиатрических популяциях.
- Прогностическая ценность: способствует биологическому снижению рисков за счет корреляции профилей медиаторов с клиническими фенотипами, такими как бессимптомная вирусная инфекция и эффекты воздействия при контакте с сиблингами.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: позволяет получать образцы элюированного белка, совместимые с высокочувствительными электрохемилюминесцентными мультиплексными массивами для количественного иммунного профилирования.
- Стандартизация: использование единообразных протоколов абсорбции фильтровальной бумагой и элюции обеспечивает воспроизводимое восстановление аналитов у разных субъектов и в разные моменты времени.
- Масштабируемость: продемонстрированная осуществимость метода на больших когортах новорожденных (n=620) подтверждает возможность применения высокопроизводительного скрининга в эпидемиологических и интервенционных исследованиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: позволяет проводить лонгитюдный забор проб от рождения до детского возраста, связывая иммунные сигнатуры раннего периода жизни с последующими исходами респираторных заболеваний.
- Согласованность биомаркеров: выявляет повышенную экспрессию иммунных медиаторов 1-го и 17-го типов у бессимптомных новорожденных, инфицированных пикорнавирусом, что указывает на возможность применения данного метода для идентификации иммунных эндотипов.
- Механистическое снижение рисков: раскрывает взаимосвязь между приемом витамина D матерями и антибактериальными иммунными ответами, что помогает определить приоритетные мишени для иммуномодулирующего вмешательства.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод применим на этапе поисковой биологии, так как он позволяет осуществлять прямое измерение иммунных медиаторов in vivo, что дает возможность подбора мишеней и выяснения путей передачи сигналов перед идентификацией ведущих соединений.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез об активации иммунных путей в слизистой ткани без проведения манипуляций ex vivo или возникновения артефактов стимуляции.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные элюаты, подходящие для мультиплексного иммуноанализа, что облегчает сравнительный анализ между группами лечения или воздействия.
- Аналитика: обеспечивает определение количественных уровней медиаторов, что позволяет проводить статистическую оценку коллинеарности, активности иммунной сети и ассоциаций с фенотипами.
- Трансляционные исследования: связывает иммунные профили новорожденных с респираторными симптомами в детском возрасте и воздействием окружающей среды, что помогает принимать решения о продвижении исследований на основе стратификации рисков.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой совместимую с платформой методику отбора проб, применимую к различным моделям респираторных заболеваний и терапевтическим методам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет регистрации эндогенной иммунной активности в нативном микроокружении слизистых оболочек.
- Операционная ценность: гарантирует воспроизводимость благодаря стандартизированным процедурам сбора, элюции и хранения, что минимизирует преаналитическую вариабельность.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), связывая иммуномодулирующие механизмы с иммунными сигнатурами раннего периода жизни, что снижает биологические риски на поздних стадиях программ по респираторным заболеваниям.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию кандидатов с поправкой на риск на основе продемонстрированных эффектов на пути слизистого иммунитета в соответствующих лонгитюдных моделях на человеке.
Особенности внедрения
- Требуется обучение анатомии дыхательных путей новорожденных и технике бережного забора проб для обеспечения комфорта субъекта и целостности образцов.
- Зависимость от наличия ультрафильтрационных пробирок, шейкеров для планшетов и инфраструктуры для электрохемилюминесцентного иммуноанализа с целью определения аналитов.
- Необходима стандартизированная подготовка буфера с ингибиторами протеаз для предотвращения деградации медиаторов в процессе экстракции.
- Требуется адаптация продолжительности забора проб или размера фильтра при применении метода у детей старшего возраста или при заборе проб из других слизистых оболочек.
- Ограничено содержанием аналитов: некоторые медиаторы часто находятся ниже предела обнаружения, что требует оптимизации чувствительности анализа для мишеней с низким уровнем экспрессии.
