Прогнозирование гена Silencing через Spatiotemporal Контроль выхода siRNA из фоточувствительных полимерных нановолокон

Общая цель этих методов состоит в том, чтобы сделать невозможным прогнозирование эффективности сайленсинга малых интерферирующих РНК-опосредованных генов и облегчить контроль над результирующими уровнями экспрессии белка в пространственно-временном пространстве. Этот метод может пролить свет на структуру, функции, взаимосвязи и стимулы, реагирующие на средства доставки. Получение лучшего контроля над связыванием и высвобождением может открыть доступ к переводимым платформам и открытию лекарств, а также к технологиям регенеративной медицины.

Основными преимуществами этого метода являются то, что изменения в экспрессии генов могут контролироваться и прогнозироваться на основе с помощью простых анализов высвобождения миРНК и кинетического моделирования. Несмотря на то, что в этих методах используются новые фоточувствительные полимеры, этот набор анализов может быть легко адаптирован для тестирования широкого спектра других систем, реагирующих на стимулы. Для начала приготовьте раствор миРНК с концентрацией 32 микрограмма на миллилитр, добавив миРНК в 20 микромолярный раствор HEPES при pH 6.

Затем приготовьте полимерный раствор, добавив растворенные полимеры mPEG block polyAPN BMA в 20 миллимолярный раствор HEPES при pH 6. Для достижения концентрации в 220 микрограммов на миллилитр эта концентрация приведет к соотношению N к P, равному четырем, что означает, что аминных групп на полимере будет в четыре раза больше, чем фосфатных групп на миРНК. Затем добавьте полимерный раствор по каплям в равный объем раствора миРНК, осторожно перемешивая на вихревой машине.

Продолжайте делать вихрь в течение 30 секунд после добавления полимера. Затем инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавляйте раствор STS к каждому раствору наноносителя по каплям, осторожно перемешивая на вихревой машине.

Продолжайте движение в течение 30 секунд после издания паспорта безопасности. Центрифугируйте образцы при давлении 3000 G в течение пяти секунд, затем инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Откалибруйте и установите УФ-лазер с фильтром 365 нанометров на интенсивность 200 Вт на квадратный метр.

Далее прорежьте отверстие в резиновой прокладке, поместите резиновую прокладку на вымытое и высушенное предметное стекло. Нанесите раствор наноносителя SDS на предметное стекло внутри отверстия резиновой прокладки. Загрузите излишки раствора на предметное стекло, избегая при этом контакта с резиновой прокладкой.

Поместите вторую стеклянную заслонку поверх прокладки предметного стекла. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, сначала опустите один конец предметного стекла вниз, а затем медленно опустите другой конец. Прикрепите связующие зажимы к каждой стороне стеклянной камеры, чтобы держать ее близко.

Облучайте образцы в течение желаемого периода времени с помощью УФ-лазера с фильтром 365 нанометров с интенсивностью 200 Вт на квадратный метр. Снимите зажимы для связующего вещества и откройте камеру. Затем пипетируйте 25 микролитров облученных образцов наноносителя SDS на микроцентрифужные пробирки.

Инкубируйте растворы в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавьте пять микролитров загрузочного буферного раствора к 25 микролитрам каждого образца SDS наноносителя. Инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем загрузите 30 микролитров каждого образца SDS на наноносителе в 2%-ный агарозный гель, предварительно окрашенный бромидом этидия. Запустите гель в темноте при напряжении 100 вольт в течение 30 минут. Визуализируйте гель с помощью системы визуализации геля с фильтрами из бромида этидия.

Сохраните файлы изображений геля и перейдите к количественному измерению интенсивности изгиба, как описано в текстовом протоколе. Снимите листы бумаги с двусторонней клейкой распорки, чтобы обнажить клейкую поверхность. Прикрепите распорку к стеклянной крышке.

Нанесите пипеткой раствор наноносителя SDS на крышку. Затем поместите предварительно вымытый предметный стеклак поверх защитного стекла с отверстием от клейкой распорки, центрированной вокруг образца. Нажмите на предметное стекло, чтобы убедиться, что предметное стекло и защитное стекло хорошо прикреплены и образуют уплотнение.

Для измерений FCS используйте конфокальный микроскоп с 40-кратным водяным иммерсивным объективом с числовой апертурой 1,2. Используйте соответствующий лазерный канал возбуждения, чтобы собрать не менее 30 измерений по 10 секунд каждое для каждого образца. Затем введите данные о высвобождении миРНК из FCS в кинетическую модель, чтобы предсказать реакцию сайленсинга генов, как подробно описано в текстовом протоколе.

Чтобы приготовить доставку миРНК in vitro, сначала добавьте два миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночного планшета. Дайте клеткам прилипнуть и восстановиться в течение 24 часов в инкубаторе. После промывания клеток фосфатно-соевым буфером подготовьте их к трансвекции, добавив 1,5 миллилитра сыворотки и трансвекционную среду, не содержащую антибиотиков.

Далее добавьте 25 микролитров раствора наноносителя, содержащего по 30 пикомолев миРНК тп в каждую лунку. Аккуратно пипеткой перемешивайте среду вверх и вниз. Поместите клетки в инкубатор на три часа.

Удалите трансвекционную среду и промойте каждую лунку PBS. Затем добавьте один миллилитр добавки питательной среды и поместите клетки в инкубатор для восстановления в течение 30 минут. Чтобы подготовить клетки к лечению фотостимулом, удалите дополненную питательную среду.

Затем добавьте по одному миллилитру трансвекционной среды в каждую лунку. После калибровки УФ-лазера, как описано в текстовом протоколе, поместите элементы на горячую плиту с температурой 37 градусов Цельсия. Снимите крышку с шестилуночной пластины.

Облучайте ячейки сверху пластины в течение нужного времени с помощью ультрафиолетового лазера с фильтром 365 нанометров с интенсивностью 200 Вт на квадратный метр. Удалите трансвекционную среду и добавьте два миллилитра дополненной питательной среды. Поместите клетки в инкубатор до дальнейшего анализа.

Чтобы подготовить фотошаблон, который полностью блокирует свет 365 нанометров и сводит к минимуму отражения, сначала вырежьте, пробежайте и/или обточите нужную форму в фотошаблоне. Приклейте фотомаску к нижней части пластины с шестью лунками так, чтобы узор был центрирован на лунке, содержащей клетки, и антибликовой стороной, обращенной к пластине. Установите две кольцевые стойки на расстоянии примерно 25 метров друг от друга и отсоедините платформу к каждой кольцевой стойке так, чтобы платформы были одинаковой высоты.

Подвесьте пластину ячейки между двумя стойками, положив пластину на верхнюю часть платформ. Облучайте клетки снизу образца в течение нужного времени, используя ультрафиолетовый лазер с фильтром 365 нанометров, с интенсивностью 200 Вт на квадратный метр. Удалите трансвекционную среду и добавьте два миллилитра дополненной питательной среды.

Затем поместите клетки в инкубатор для восстановления в течение как минимум 24 часов. Визуализируйте клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, как описано ранее. Здесь показан пример простого кинетического моделирования динамики сайленсинга генов.

Модель была запущена для прогнозирования концентраций мРНК, белка и миРНК в зависимости от времени после фотоиндуцированного высвобождения миРНК. Относительные количества миРНК, высвобождаемых при различных дозировках света, были введены в качестве начальной концентрации миРНК в кинетической модели. Полученные модельные прогнозы для уровней экспрессии белка согласуются с экспериментально определенными уровнями экспрессии, полученными с помощью вестерн-блоттинга.

Для визуализации клетки, экспрессирующие GFP, обрабатывали GFP, нацеленным на миРНК, и перед облучением на пластину помещали анулярную фотомаску для создания кругового узора. Клетки, которые были защищены от света, демонстрировали интенсивность флуоресценции, неотличимую от контрольных образцов, не обработанных миРНК и светом. Тем не менее, почти все клетки в пределах круговой структуры не проявляли экспрессии GFP, что указывает на эффективное высвобождение миРНК и нокдаун генов.

Более того, использование света является триггером для экспрессии генов, которую можно контролировать в масштабах клеточной длины. Таким образом, этот метод позволяет быстро определять условия облучения для пространственно-временного контроля высвобождения миРНК и априорного прогнозирования сайленсинга генов. Использование этого протокола поможет пролить свет на структурно-функциональные взаимосвязи, определяющие стабильность и эффективность наноносителей.

Этот метод может быть использован в регенеративной медицине, которая требует пространственно-временного контроля над экспрессией генов. Эти составы также хорошо подходят для лечения локализованных заболеваний, таких как рак кожи, а также дерматологических заболеваний.