Среднесрочная подготовка Drosophila Экстракты эмбрионов для протеомических экспериментов

Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить простой и недорогой подход к сбору эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г) и приготовлению белковых экстрактов, которые могут быть использованы в протеомических применениях ниже по течению, таких как масс-спектрометрия с аффинной очисткой (AP-MS ).

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы обеспечить простой и недорогой подход к сбору эмбрионов дрозофилии в средних масштабах. И приготовление белковых экстрактов, которые можно использовать в последующих протеомных приложениях, таких как масс-спектрометрия аффинной очистки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной сигнализации и биологии развития.

Например, как специфические белки, белковые взаимодействия осуществляют клеточную коммуникацию во время развития организма. Основное преимущество этой методики заключается в том, что это простой и недорогой метод получения лизиса эмбриона дрозофилы. Который можно использовать для последующих применений, таких как аффинная очистка белка.

Традиционно исследователи собирали эмбрионы дрозофилы в очень больших клетках. Но мы представляем удобную процедуру сбора эмбрионов в клетки среднего размера, которые можно легко установить в любой лаборатории. Подготовив пятилитровые емкости и нарезав квадраты капроновой сетки размером 25 на 25 сантиметров, согласно текстовому протоколу, поместите сетку над емкостью и придавите крышкой.

Убедитесь, что сетка плотно затянута, а крышка не наклонена. Теперь клетка готова к заселению мухами. После подготовки литровых пластиковых банок и квадратов капроновой сетки размером 18 на 18 сантиметров, поместите сетку на верхний край банки и закрутите крышку, чтобы закрутить.

Убедитесь, что сетка плотно затянута, а крышка не наклонена. Амплифицируйте трансгенные линии мух, несущих типированный белок, представляющий интерес. И перекладывайте бутылки каждые два дня, пока не накопится от 25 до 30 бутылок на каждую нахлыстовую леску.

Аналогичным образом усилите контрольный приклад. Далее прогрейте тарелки яблочного сока до комнатной температуры. Затем пальцем в перчатке намажьте по центру тарелок немного влажной дрожжевой пасты.

Делаем примерно шестисантиметровый круг для 15-сантиметровой тарелки. И четырехсантиметровый круг для 10-сантиметровой тарелки. Обезболив мух, и перенеся их в подготовленные клетки сеткой вниз, накройте клетки пластинами с яблочным соком.

Дайте мухам проснуться. Затем переверните клетки и высиживайте мух при комнатной температуре в течение двух-трех дней. Меняйте пластины два раза в день, перевернув клетку вверх дном, и, прижимая пластину к клетке, отклеивайте ленту от тарелки.

Аккуратно постучите по всей клетке на скамейке и быстро поменяйте местами старую пластину на новую, стараясь не дать мухам сбежать. Дайте мухам отложить эмбрионы на тарелки со свежим яблочным соком на ночь или на любой другой желаемый период времени. На следующее утро промаркируйте и взвесьте сетчатые контейнеры для сбора эмбрионов.

По одному на каждую используемую нахлыстовую леску. Приготовьте 1x Lysis Buffer в 50 миллилитровой пробирке, используя ранее изготовленные реагенты, добавив 40 миллилитров воды к 10 миллилитрам 5x концентрированного лизисного буфера в 50 миллилитровой пробирке. Добавьте 50 микролитров одного моляра DTT в конечной концентрации одного милли моляра.

Хорошо перемешайте и разделите раствор между двумя тюбиками по 50 миллилитров. В одну из пробирок добавьте одну таблетку ингибитора протеазы. И поместите трубку на вращатель при температуре четыре градуса Цельсия на 30 минут.

Пока таблетка растворяется, начните сбор эмбрионов, пометив пластины с яблочным соком на клетках, с указанием генотипов используемых линий мух. И поменяйте тарелки местами на свежие. Добавьте достаточно воды, чтобы покрыть каждую тарелку с яблочным соком.

Затем мягкой кистью аккуратно выбить зародыши из тарелки. Высыпьте зародыши в предварительно взвешенную и размеченную сетчатую емкость и слейте лишнюю воду. Затем коротко промокните сетку на бумажных полотенцах, чтобы удалить лишнюю воду.

Чтобы дехорионизировать эмбрионы, наполовину заполните шестисантиметровую чашку Петри 50% хлорной известью. Затем приготовьте две большие чашки Петри с водой. Погрузите сетчатый контейнер с эмбрионами, в 50% хлорную известь на 90 секунд.

Аккуратно постучите по сетке во время инкубации пару раз, чтобы подвесить зародыши в растворе отбеливателя. В конце инкубации используйте воду, чтобы вымыть сетчатый контейнер в каждой из двух посуд, в течение примерно 10 секунд. Затем используйте 18,2 мегам сантиметровой воды в бутылке для распыления, чтобы тщательно промыть сетчатую емкость, включая боковые стороны и внешнюю сторону.

После тщательной стирки не должно быть обнаружено запаха отбеливателя. Промокните сетчатую емкость на бумажных полотенцах. Затем взвесьте сетчатый контейнер с эмбрионами и вычтите вес пустого контейнера.

Запишите полученный вес эмбрионов. Чтобы приготовить экстракт эмбриона, добавьте один миллилитр буфера для лизиса с ингибиторами протеазы в гомогенизатор для стекла Dounce и держите его на льду. Затем перенесите эмбрионы из сетчатого контейнера в гомогенизатор.

Используйте один миллилитр буфера для лизиса, чтобы смыть оставшиеся на сетке эмбрионы. И добавьте зародыши и буфер к материалу в гомогенизаторе. Затем дайте эмбрионам осесть на дно гомогенизатора и осторожно отсасывайте надосадочную жидкость.

Затем добавьте в гомогенизатор Lysis Buffer с ингибиторами протеазы, стремясь к пяти-шести миллилитрам Lysis Buffer на грамм эмбрионов. Затем вставьте свободно прилегающий пестик, чтобы гомогенизировать эмбрионы с помощью четырех-шести ударов. Во время первых ударов сопротивление будет больше.

Старайтесь двигать пестиком непрерывным движением, чтобы избежать разбрызгивания раствора. Затем переключитесь на плотно прилегающий пестик. И гомогенизировать эмбрионы с помощью восьми-10 ударов.

Выдержите гомогенид на льду в течение 20 минут. Затем переложите гомогенид в микроцентрифужные пробирки. И центрифугируйте при 13 000 времени G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Избегая попадания гранул в самый верхний липидный слой, перенесите надосадочную жидкость в свежие микроцентрифужные пробирки на льду. После повторения центрирования с помощью одномиллилитрового наконечника тщательно соберите надосадочную жидкость. И переложите их в охлажденные шприцы объемом 10 миллилитров с прикрепленными фильтрами 045 микрометров.

Выдавите весь раствор в маркированные двухмиллилитровые микроцентрифуги на льду. Snap заморозьте образцы в жидком азоте и храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия. Или использовать сразу для экспериментов по очищению белка.

Используя протокол, описанный в этом видео, лизаты были получены из эмбрионов дрозофилы, повсеместно экспрессирующих белок EGFP-ERK, под контролем промотора arm-odillo. Экспрессия белка была подтверждена методом Western Blotting для общего белка ERK для одновременного обнаружения уровней эндогенного и трансгенного EGFP-ERK, мигрирующих в 42 килодальтонах и 69 килодальтонах соответственно. В желто-белой контрольной линии была обнаружена одна полоса, соответствующая немеченому эндогенному ERK, что подтверждает успешную экстракцию ERK и EGFP-ERK из эмбрионов.

Чтобы проверить, подходит ли протокол экстракции для последующей очистки меченого белка, экстракты из желто-белого и мух arm-EGFP-ERK были подвергнуты аффинной очистке с использованием агарозных бусин GFP. Серебристое окрашивание образцов выполняется по градиенту SDS-PAGE, показывает успешную очистку приманки белком EGFP-ERK. Помимо EGFP-ERK, экспериментальная полоса содержала дополнительные полосы, не наблюдавшиеся в контрольном образце, что позволяет предположить, что в результате очистки были восстановлены потенциальные белки, взаимодействующие с ERK.

После освоения этапы сбора эмбрионов и экстракции могут быть выполнены примерно за два часа. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о выполнении операций экстракции на льду. И использовать ингибиторы протеазы для минимизации деградации белка.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обустраивать клетки для популяции дрозофил в средних масштабах. И делать цельноклеточные белковые экстракты из эмбрионов.