Переключаемая акустическая и оптическая разрешающая фотоакустическая микроскопия для В Виво Масштабная картинка клеток

Общая цель этой процедуры заключается в демонстрации системы фотоакустической микроскопии с переключаемым акустическим и оптическим разрешением для визуализации сосудистой сети крови мелких животных in vivo. Фотоакустическая микроскопия — это быстрорастущий метод визуализации in vivo, который сочетает в себе оптику и ультразвук, обеспечивая глубину изображения за пределами оптического пути с высоким разрешением. Данная работа представляет собой переключаемую акустическую фотоакустическую микроскопическую систему с оптическим разрешением, способную получать изображения с более высоким разрешением на небольшой глубине, а также с более низким разрешением для визуализации глубоких тканей того же образца in vivo.

Демонстрировать процедуру будут доктор Мохеш Мутанчери, научный сотрудник из моей лаборатории, и Арунима Шарма, аспирант из моей лаборатории. Во-первых, постройте наносекундную перестраиваемую лазерную систему из твердотельного лазера Nd:YAG с диодной накачкой и дифференцируемого лазера с диапазоном от 559 до 576 нанометров. Установите дифференцируемый лазер на 570 нан.

Закрепите на оптическом столе акриловый бак с семисантиметровым полиэтиленовым окошком для визуализации в полу бака. Закрепите столик визуализации на оптическом столбе под окном визуализации. Над танком смонтируйте оптическую клетку, содержащую систему визуализации AR-OR-PAM на переключающей пластине, прикрепленной к управляемому компьютером трехосевому моторизованному столику для трансляции.

Для настройки системы для AR-PAM используйте правую угловую призму, установленную на моторизованном непрерывном вращающемся столике, чтобы направить луч через фильтр переменной плотности нейтрали на многомодовый оптоволоконный кабель с оптоволоконным соединителем 25 NA. Подключите оптоволоконный выход к столику преобразования XY в системе визуализации. Направьте луч через плоскую выпуклую линзу в 25 миллиметрах от выхода, а затем через коническую линзу, чтобы создать кольцеобразный луч.

Сфокусируйте кольцеобразный луч на оптическом конденсоре вокруг ультразвукового преобразователя с частотой 50 мегагерц с акустической линзой, установленной на выходе преобразователя. Далее, чтобы настроить систему для OR-PAM, поверните первую прямоугольную призму на 90 градусов, чтобы направить лазерный луч через радужную оболочку, фильтр переменной нейтральной плотности, линзу конденсора и отверстие, установленное на расстоянии 75 миллиметров от линзы конденсора. Используйте одномодовый оптоволоконный ответвитель 1 NA и одномодовое волокно для отправки луча на стадию Z-трансляции в системе визуализации.

Направляйте луч через ахроматическую дуплетную линзу, установленную в 50 миллиметрах от выхода волокна. Перенаправьте луч с помощью кинематического, управляемого, эллиптического зеркала на вторую ахроматическую дуплетную линзу в линзовой трубке. Сфокусируйте луч на прямоугольной призме, отделенной слоем кремниевого масла от ромбовидной призмы, несущей акустическую линзу и ультразвуковой преобразователь с частотой 50 мегагерц, который образует сканирующую головку OR-PAM.

Перед началом юстировки системы заполните акриловые баки дегазированной водой. Затем с помощью трехосевого моторизованного столика переместите сканирующий узел над резервуаром. Опускайте узел до тех пор, пока акустические линзы обеих систем не будут погружены в воду.

Включите лазер. Подключите ультразвуковые преобразователи к двум 25-децибельным усилителям с фиксированным коэффициентом усиления. Расположите сканирующую головку AR-PAM над окном изображения.

Поместите стеклянное стекло, обмотанное черной изолентой, на предметный столик и поднимите предметное столико, чтобы предметное стекло соприкоснулось с окном изображения. Регулируйте коническую линзу до тех пор, пока амплитуда фотоакустического сигнала, генерируемого предметным стеклом, не достигнет максимума, что указывает на то, что оптическая и акустическая линзы находятся в одном фокусе. Затем вручную переключитесь на систему OR-PAM.

Отрегулируйте ахроматический дуплетный объектив до тех пор, пока оптические и акустические линзы не станут конфокальными, как показано путем максимального увеличения амплитуды фотоакустического сигнала от заклеенного скотчем предметного стекла. Чтобы определить боковое разрешение каждой системы, сначала поместите 1 миллилитр разбавленного раствора 100-нанометровых наночастиц золота в воду на покровный листок. Поместите предметное стекло на предметный столик изображения.

и поднимайте столик до тех пор, пока раствор наночастицы не коснется окна визуализации. Переключите лазер и сканирующую головку на систему AR-PAM. Настройте программное обеспечение прибора для сканирования AR-PAM и выполните сканирование одного растра.

Повторите этот процесс для системы OR-PAM. Затем снимите предметное стекло и очистите окно изображения спиртовым тампоном. Подгонка функций разброса точек, определенных по полученным изображениям, к кривой Гаусса.

Полная ширина в половине максимума является боковым разрешением для соответствующей системы сканирования. Затем, чтобы определить максимальную глубину визуализации в ткани, сначала вставьте острую металлическую пластину, обернутую черной лентой, в небольшой участок куриной ткани под небольшим углом. Поместите салфетку в резервуар для воды под головкой сканера.

Получите одно изображение B-скана для каждой системы. Измерьте глубину под поверхностью ткани, на которой черная лента больше не видна. Перед съемкой убедитесь, что полиэтиленовое окно для визуализации и сцена для визуализации животных чистые.

Затем приобретите 25-граммовую четырехнедельную самку мыши для процедуры визуализации после анестезии мыши. Удалите волосы с поверхности ушей с помощью крема для депиляции. Нанесите стерильную глазную мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость и блокировать рассеянные лазерные лучи.

Поместите мышь на столик для визуализации так, чтобы пластина для позиционирования уха была изображена. Следите за физиологическим состоянием мыши с помощью пульсоксиметра, прикрепленного к хвосту или ноге мыши. Нанесите ультразвуковой гель на ухо, которое необходимо изобразить.

Медленно поднимите предметный стол, чтобы аккуратно приблизить ухо к полиэтиленовому окошку для визуализации. Проводите растровые сканирования уха мыши с помощью AR-PAM и OR-PAM, отслеживая физиологическое состояние мыши на протяжении всего процесса. Дайте мыши полностью восстановиться после создания образа.

Сосудистая система крови мыши была визуализирована in vivo с помощью переключаемой системы AR-OR-PAM. Кровеносные сосуды толще 45 микрометров были хорошо видны на изображении AR-PAM. Отдельные капилляры шириной около пяти микрометров были разрешены с помощью визуализации OR-PAM.

Комбинированная система AR-OR-PAM имеет боковое разрешение примерно четыре микрона. И в точке визуализация четырех мм для OR-PAM и примерно 45 микрометров бокового разрешения и 7,8 мм визуализации для AR-PAM. Переключаемая комбинированная система AR-OR-PAM позволяет получать изображения без перемещения образца между различными системами визуализации.

Разработанная система может быть использована для доклинической визуализации. Основные доклинические приложения включают визуализацию андрогенеза, опухолевого микроокружения, микроциркуляции, реакции на лекарства, функцию мозга, биомаркеры и активность генов.