Простое управление архитектуры в гидрогели на основе белков для приложений культуры клеток

Общая цель данной методологии заключается в создании макропористых гидрогелей с различными размерами пор для применения в клеточных культурах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области 3D-клеточных культур, такие как принципиальная осуществимость нового гидрогелевого материала для применения в 3D-культурах клеток. Основное преимущество этой методологии заключается в том, что она предлагает ряд методов для оптимизации и адаптации нового материала к требованиям различных типов клеток.

Для начала разведите один миллиграмм пептида RGD или эквивалентного клеточного адгезивного пептида в 100 микролитрах стерильной воды, чтобы получить раствор из расчета 10 мг на миллилитр. Затем снимите дно пластины на 96 лунку и замените ее съемной полиэтиленовой пленкой. Смешайте 100 микролитров стокового раствора BSA и 100 микролитров стокового раствора THPC в 96-луночной пластине, чтобы получить 200 микролитров гидрогеля.

Смешайте компоненты с помощью пипетирования вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы гарантировать однородный гидрогель после полимеризации. Поместите 96-луночный планшет при комнатной температуре примерно на 10 минут, пока все гидрогели не полимеризуются должным образом. После полимеризации осторожно и медленно снимите пищевую пленку со дна тарелки.

Выдавите гидрогели из 96-луночного планшета с помощью небольшого укола и перенесите их в 1,5-миллилитровые пробирки со стерильным PBS pH 7,4. Храните гидрогели в фосфатно-солевом буфере при температуре четыре градуса Цельсия до нескольких месяцев. Чтобы сублимационно высушить гидрогели, сначала заполните 1,5 миллилитровые тубы 500 микролитрами стерильной деионизированной воды и снимите крышки.

Перенесите гидрогели в реакционные пробирки объемом 1,5 миллилитра с помощью щипцов. Плотно оберните тубы объемом 1,5 миллилитра парафиновой пленкой, используя не менее трех слоев для каждого флакона. С помощью иглы проткните небольшие отверстия в пленке, чтобы обеспечить выход газа из трубок.

Чтобы гарантировать полное замерзание воды и гидрогеля, переложите флакон в раствор жидкого азота на пять минут. Сразу после удаления из жидкого азота переместите флаконы в сублимационную сушилку, чтобы предотвратить оттаивание материала. В качестве альтернативного шага замораживания держите флаконы при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы медленно заморозить гидрогели.

Сразу после снятия с минус 20 градусов по Цельсию перенесите флаконы в сублимационную сушилку, чтобы предотвратить оттаивание материала. Через 24 часа после полного испарения воды в гидрогеле и вокруг него разморозьте материал, вынув его из сублимационной сушилки. Для вымывания частиц смешайте компоненты гидрогеля как и раньше.

После перемешивания сразу же добавьте хлорид натрия до тех пор, пока не произойдет насыщение. Добавляйте соль до тех пор, пока кристаллы соли не будут видны в растворе в виде белого осадка. Размер пор можно изменить, измельчив кристаллы соли перед использованием.

Переложите 96-луночную пластину в шейкер и встряхивайте до тех пор, пока не произойдет полимеризация. Примерно через 10 минут снимите гидрогели с пластины, как и раньше. Инкубируйте гидрогели не менее 24 часов при комнатной температуре в стерильной воде на ротаторе, чтобы удалить всю соль из гидрогелевого шаблона.

Храните гидрогели при температуре четыре градуса Цельсия в PBS до нескольких месяцев. Для бережного формирования приготовьте гидрогели, как описано выше. Затем удалите гидрогель из раствора с помощью клещей.

Удалите лишнюю воду с помощью бумаги с высокой впитывающей способностью и положите ее поверх блока сухого льда. Заморозьте гидрогель в течение 30 секунд и осторожно извлеките его из блока. Не повреждайте гидрогель.

Осторожно с помощью шпателя соскребите его с блока. Переложите гидрогель в тюбик объемом 1,5 миллилитра и высушите его в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Приготовьте стоковый раствор Родамина В, а также серийные разведения, как описано в текстовом протоколе.

Извлеките гидрогель из хранящегося раствора и переложите его в 1,5-миллилитровую пробирку с одним миллилитром 0,01 миллиграмма на миллилитр раствора родамина В. Окрасьте гидрогель на ночь в раствор родамина В комнатной температуры. На следующий день перелейте гидрогель, который должен быть визуализирован, в 10 миллилитров PBS и умывайтесь не менее трех часов.

Вырежьте из гидрогеля небольшие ломтики с помощью лезвия. Затем переложите гидрогель на восьмилуночное микроскопическое предметное стекло и накройте его PBS. С помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа визуализируйте гидрогель на длине волны 514 нанометров.

Стерильно отфильтровать все стоковые растворы с помощью фильтра 0,45 мкм. Начните приготовление гидрогеля и включите в него клеточный адгезивный пептид до полимеризации гидрогеля. Смешав компоненты, сразу же пипетируйте смесь в восьмилуночное микроскопическое горло до полного покрытия дна.

Перенесите клетки в предварительно подогретую стерильную среду для культивирования клеток DMEM, дополненную фетальной бычьей сывороткой, пенициллином, стрептомицином и раствором заменимых аминокислот. После подсчета клеток счетной камерой Нейбауэра осторожно нанесите на поверхность гидрогеля 200 микролитров нужного количества клеток. Накройте восьмилуночное микроскопическое предметное стекло крышкой и переложите его в инкубатор.

По прошествии не менее четырех часов прикрепления клеток дважды промойте клетки 200 микролитрами стерильной клеточной культуры PBS. Далее зафиксируйте ячейки 200 микролитрами 3,7%-ного формальдегида на 10 минут при комнатной температуре и дважды промойте PBS. Пропитайте клетки 200 микролитрами 0,1% Triton X в течение пяти минут, а затем еще дважды промойте PBS.

Окрасьте клетки толуидином родамином, смешав пять микролитров метанольного запаса со 195 микролитрами PBS и добавив его в клетки при комнатной температуре. Окрашивайте клетки в течение 20 минут в темноте, прежде чем дважды промыть PBS. Исследуйте свойства адгезии клеток с помощью конфокального микроскопа с яркостью 514 нанометров.

Проанализируйте свойства гидрогеля, как описано в текстовом протоколе. Как показано здесь, полимеризованные и окрашенные гидрогели не имеют характерной архитектуры. После сублимационной сушки гидрогелей при различных температурах средний размер пор внутри гидрогеля может быть увеличен до 60 микрон.

В результате выщелачивания солей образуются однородные сети с размером пор около 10 мкм. Размер можно дополнительно отрегулировать путем измельчения кристаллов соли перед использованием. Применение градиентного подхода к замораживанию на глыбе сухого льда приводит к образованию каналов диаметром около 20 мкм и длиной в несколько сотен мкм.

До функционализации с помощью клеточной адгезивной группы клетки не могут прилипать к поверхности гидрогеля и имеют круглую морфологию. Только после введения в материал клеточного адгезивного пептида, клетки находят очаговые точки адгезии, которые обеспечивают надлежащую адгезию клетки к материалу. Это имеет решающее значение для использования новых материалов в 3D-культурах клеток.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как манипулировать архитектурой гидрогеля простыми методами. Этот метод может быть применен к большинству новых гидрогелевых систем для изучения использования в клеточных культурах и оптимизации архитектуры гидрогеля в зависимости от предполагаемого использования.