Протокол сканирования часов для анализа изображений: плагины ImageJ

Общая цель данных протоколов циклического сканирования (clock scan) заключается в обеспечении быстрой характеристики средней интенсивности пикселей внутри, вдоль границы и/или за пределами выбранных областей интереса. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы и обучить аналитиков изображений определению средней интенсивности пикселей в конкретных областях интереса. Основным преимуществом метода циклического сканирования в данном случае является возможность оперативной характеристики средней интенсивности пикселей с орбиты в одной или нескольких областях интереса.

Для стандартного анализа сканирования по методу «биологических часов» в соответствующей программе ImageJ выберите пункт Open в меню File, чтобы открыть интересующий вас файл изображения. Например, в данном случае будет проанализирован срез ткани с нейронами, помеченными специфическим белком. Выберите подходящий инструмент рисования и обведите область интереса.

Выберите Plugins, а затем Clock Scan в меню File, чтобы открыть стандартный протокол сканирования часов в окне параметров. Также откроется окно менеджера областей интереса (region of interest manager) с автоматически добавленным контуром. В окне параметров плагина используйте полосы прокрутки, чтобы при необходимости изменить координаты x и y центра области интереса.

В зависимости от того, какая часть фоновой области за пределами объекта должна быть охвачена сканированием, используйте ползунок ограничения сканирования для настройки границ сканирования. В соответствии с условиями эксперимента отметьте флажками соответствующие пункты: real radius (реальный радиус), subtract background (вычесть фон), polar transform (полярное преобразование) и/или plot with standard deviation (построить график со стандартным отклонением). Затем нажмите OK для запуска плагина.

После завершения анализа используйте команду list для доступа к числовым данным для дальнейшего анализа. Для анализа сканирования циферблата (clock scan) нескольких областей откройте файл изображения, содержащий несколько областей интереса. Например, здесь будет проанализирована панель кадров, полученных из одного и того же среза ткани, как было только что продемонстрировано.

Нажмите Analyze, затем Tools, далее Region of Interest Manager и с помощью подходящего инструмента рисования обведите каждую область интереса. Инструмент сегментированной линии удобен для выбора асимметричных областей интереса и исключения фонового окрашивания. Нажимайте Add в окне Region of Interest Manager, чтобы добавлять каждую выбранную область интереса в менеджер.

в меню Plugins выберите Multi Clock Scan, чтобы открыть всплывающее окно с параметрами протокола, и при необходимости сбросьте лимит сканирования. Отметьте флажками пункты plot with standard deviation (построить график со стандартным отклонением) и/или subtract background (вычесть фон), исходя из условий эксперимента. Затем нажмите OK для запуска протокола, в результате чего откроются два окна с результирующими графиками.

Для анализа серии изображений методом сканирования тактового сигнала (clock scan) откройте интересующий вас стек изображений. В данном примере будет проведен анализ стека изображений изолированного ганглия заднего корешка, меченного чувствительным к кальцию флуорофором, полученных до и после стимуляции внутриклеточным электродом. Очертите область интереса в стеке изображений.

Добавьте выбранный стек изображений в менеджер областей интереса (ROI manager), как было только что продемонстрировано, и выберите Multi Clock Scan, чтобы открыть всплывающее окно с параметрами протокола. При необходимости сбросьте лимит сканирования, а также отметьте пункты «plot with standard deviation» (график со стандартным отклонением) и/или «subtract background boxes» (вычитание фоновых областей), в зависимости от условий эксперимента. Затем нажмите OK для запуска протокола, в результате чего будут созданы два окна с выходными графиками.

В данном репрезентативном анализе среза ткани с флуоресцентно меченными нейронами область интереса была выделена по яркому сигналу искомого белка, после чего был проведен стандартный анализ сканирования по типу циферблата для сбора радиальных профилей интенсивности пикселей от центра области интереса до обозначенного предела сканирования. Радиальные сканы были нормированы по радиусу области интереса в направлении сканирования. Было вычислено среднее значение для получения интегрального радиального профиля интенсивности пикселей, который показал, что большая часть искомого белка локализована на плазматической мембране клетки.

Поскольку для данного анализа был выбран график со стандартным отклонением, вертикальные линии стандартного отклонения указывали на разброс интенсивности пикселей отдельных профилей радиального сканирования на заданном расстоянии от начала сканирования. В ходе этого анализа, как было только что продемонстрировано, сканировались несколько областей интереса в образце ткани нейрона, в результате чего формировался интегральный профиль интенсивности пикселей для каждого сканированного объекта в последовательности их добавления в менеджер областей интереса, а также усредненный профиль интенсивности пикселей для каждой выбранной области интереса.

Таким образом, данные полосы стандартного отклонения отражают вариабельность между интегральными сканами отдельных объектов, а не между отдельными радиальными сканами. В данном случае был проведен анализ стека изображений изолированного нейрона спинномозгового ганглия, полученных в разное время — до и после стимуляции с помощью внутриклеточного электрода. По завершении анализа был представлен профиль интегральной интенсивности пикселей для отдельных экземпляров интересующего объекта на разных изображениях внутри стека, а также средний профиль интенсивности пикселей для всех экземпляров объекта.

Кроме того, анализ стандартного отклонения стека изображений, полученных методом clock scan, демонстрирует вариабельность данных между интегральными сканами во всем стеке изображений. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять интенсивность пикселей с помощью плагинов clock scan. Нашей целью при разработке этих плагинов было сделать подобные виды анализа изображений общедоступными для всех исследователей.

Мы полагаем, что протокол сканирования по часам (clock scan) найдет применение во многих областях исследований, включая, помимо прочего, биологическую, химическую и физическую визуализацию. По мере дальнейшей разработки и эксплуатации этих плагинов для сканирования по часам мы будем признательны за любые отзывы и предложения от заинтересованных сторон по совершенствованию данных инструментов.