Определение оптимальной частоты ингибирования для злокачественных клеток с использованием полей для лечения опухолей (TTFields)

Общей целью прикладной системы TTFields in vitro является исследование их влияния на раковые клетки из различных типов опухолей, руководство клиническим введением TTFields и оптимизация результатов лечения. Этот метод может помочь определить влияние различных параметров TTField на раковые клетки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет доклинически идентифицировать наиболее эффективную частоту TTField, которая ингибирует рост определенной линии раковых клеток, что в конечном итоге может быть применено у человека.

Путем незначительной модификации этой методики можно проверить эффективность комбинированного лечения TTField и других методов лечения, таких как химиотерапевтические препараты и лучевая терапия. Демонстрировать процедуру будет Яара Порат, исследователь из нашей команды. Для начала установите тарелки TTFields с крышками на опорную плиту и подготовьте еще восемь тарелок, которые будут использоваться для выращивания контрольных клеток.

Положите стерильный двухмиллиметровый покровный лист на дно каждой посуды. Далее суспендировать пять раз по 10 до четвертой U-87 MG клеток в одном миллилитре среды DMEM. Соответствующее количество ячеек в каждой чашке зависит от свойств используемой клеточной линии.

Очень важно откалибровать его перед экспериментом, чтобы избежать чрезмерного разрастания клеток. Нанесите 200 микролитров клеточной суспензии на каждую покровную камеру так, чтобы на ее поверхности образовалась капля, и накройте посуду своими крышками. Инкубируйте все блюда при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение ночи, чтобы клетки прилипли.

После того, как клетки присоединены, отсасывайте среду из покровных стекол с помощью пипетки объемом 200 микролитров, затем осторожно нанесите два миллилитра полной питательной среды на каждую чашку. Осторожно постучите стерильным наконечником пипетки по краям защитного стекла, чтобы выпустить пузырьки воздуха, попавшие под предметное стекло. После этого инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, пока не начнется лечение TTFields.

Чтобы начать обработку TTFields, снимите опорную пластину с инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия и поместите ее в охлаждаемый инкубатор с углекислым газом. Температура охлажденного инкубатора будет определять интенсивность электрического поля. Важно использовать соответствующую интенсивность, которая зависит от чувствительности клеток к TTFields.

Затем вставьте внутренний разъем плоского кабеля в опорную пластину и включите генератор TTFields. Откройте программное обеспечение, предназначенное для системы применения TTFields in vitro. После определения нового исследования, введя названия эксперимента и экспериментатора, отрегулируйте частоту и целевую температуру для каждого блюда.

Нажмите на кнопку «Пуск», чтобы запустить обработку TTFields в программном обеспечении, и проверьте, все ли блюда отображаются на мониторе светло-голубым цветом, что подтверждает их правильное подключение. Чтобы восстановить соединение, аккуратно надавите на тарелку и медленно вращайте ее вперед и назад, пока блюдо не станет светло-голубым на экране. Через 24 часа после начала лечения остановите эксперимент в программном обеспечении, нажав кнопку «Пауза».

Отсоедините плоский кабельный соединитель от опорной плиты, а затем поместите опорную плиту в шкаф с ламинарным потоком, затем снимите опорную плиту с чашками и контрольными ячейками, выращенными в стандартных условиях, из их инкубаторов. Замените среду во всех посудах свежей питательной средой, затем поместите контрольные ячейки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом и верните опорную пластину в охлаждаемый инкубатор. Снова подсоедините опорную плиту к генератору.

Продолжите лечение, нажав кнопку «Продолжить». После завершения лечения завершите эксперимент, нажав кнопку «Завершить эксперимент» в программном обеспечении, затем сохраните данные, загруженные из системы. После выключения генератора TTFields отсоедините плоский кабель от опорной плиты и извлеките систему из инкубатора.

Нажмите и поверните керамическую тарелку против часовой стрелки, чтобы отсоединить ее от опорной плиты. Затем асептически перенесите обработанные TTFields и контрольные покровные стекла в стерильные чашки Петри, содержащие свежую среду, для дальнейшей оценки. Чтобы оценить эффект обработки TTFields, удалите среду из каждой чашки, содержащей покровное стекло, затем добавьте 0,5 мл 0,25% трипсина/ЭДТА и инкубируйте чашки при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа до тех пор, пока клетки не отделятся от поверхности покровного стекла.

Нейтрализуйте трипсин с помощью 0,5 миллилитров полной питательной среды и повторно суспензируйте клетки, осторожно пипетируя суспензию вверх и вниз. Наконец, подсчитайте клетки с помощью проточной цитометрии. Представлены результаты частотного сканирования, проведенного в клетках А2780, которые выявили частотно-зависимое влияние TTFields на рост и клоногенную способность исследуемых клеток.

Наиболее выраженная эффективность лечения наблюдалась при применении частоты 200 килогерц. Эффективность лечения TTFields, проводимого в двух различных интенсивностях, была исследована в клетках OVCAR-3. Исследование показало четкую взаимосвязь между применяемой интенсивностью и результатом лечения, при этом более высокая интенсивность поля была выше, чем выше ингибиторная активность роста.

Независимо от интенсивности приложенного поля, наиболее сильный эффект от обработки TTFields наблюдался при частоте 200 килогерц. После освоения этой техники ее можно выполнять менее чем за 30 минут в день. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что необходимо избегать пролития фильтрующего материала и сохранять равновесие посуды при переносе ее из инкубатора в колпак и обратно.

После применения TTField могут быть выполнены другие методы, такие как проточная цитометрия, анализ белка аланина или иммунофлуоресцентная микроскопия, для дальнейшего изучения результата лечения и механизма, лежащего в основе наблюдаемой активности. Этот метод используется для определения оптимальных частот TTFields для применения в клинических условиях при различных типах рака. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как планировать и проводить эксперименты TTFields in vitro.

Не стоит забывать, что работа с клеточными линиями человека может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как защитные перчатки и одежда.