Пищевых патогенов скрининга с помощью магнитно люминесцентные нано: Быстрое обнаружение кишечной палочки O157: H7

Основной целью этого протокола является разработка и синтез двухмодальных наносенсоров, способных обнаруживать бактериальные загрязнители, такие как E.coli O157:H7. Магнитофлуоресцентные наносенсоры синтезируются путем функционализации наночастиц оксида железа с помощью двухступенчатой процедуры. Во-первых, антитела-мишени конъюгируются с поверхностью наночастицы.

Затем в его кодировку загружается флуоресцентный краситель. Сочетание этих методов позволяет быстро и с высокой концентрацией обнаруживать бактериальные загрязнители как в низкоконцентрированных, так и в высококонцентрированных растворах. В присутствии небольшого количества бактерий наносенсоры будут роиться вокруг бактерий из-за нацеливания на конъюгированные антитела.

Это роение изменяет взаимодействие магнитного ядра наносенсоров с окружающими протонами воды, что позволяет чувствительно обнаруживать изменения значений магнитной релаксации. По мере увеличения концентрации бактериальных загрязнителей в растворах роение уменьшается, а способность магнитной модальности количественно оценивать загрязнение снижается. Однако по мере увеличения концентрации бактерий увеличивается и флуоресцентное представление бионаносенсоров.

Именно по этой причине важно сопряжение магнитных и флуоресцентных модальностей. Эта комбинация позволила обнаружить всего одну колониеобразующую единицу E.coli O157:H7 в течение нескольких минут. Первым этапом построения магнитофлуоресцентных наносенсоров является приготовление раствора соли железа, состоящего как из феристо, так и из хлорида железа.

Железо обеспечит наносенсоры магнитным сердечником, который обеспечит его адаптацию к платформам магнитной релаксации. Дополнительными необходимыми растворами являются полиакриловая кислота и гидроксид аммония. В раствор соли железа вводят соляную кислоту, которую затем добавляют в раствор гидроксида аммония во время вортексирования.

Наконец, в раствор полиакриловой кислоты добавляют, и полученную смесь переворачивают в течение дополнительного часа, пока реакция продолжается. Полученный раствор центрифугируют для осаждения более крупных молекул и выделения наночастиц размером менее 100 нанометров. Затем раствор диализуют на ночь для очистки.

Следующим шагом является конъюгация антител-мишеней к полиакриловой кислоте, кодирующей недавно синтезированные наночастицы железа. Необходимые материалы включают буфер MES, EDC, NHS и выбранные антитела. Сначала в раствор наночастиц добавляется EDC, затем NHS и, наконец, антитело.

Затем смесь помещают на настольный миксер на три часа, пока продолжается реакция. Раствор очищают с помощью магнитной колонки. Намагниченная колонка захватывает наночастицы, позволяя выходить только свободно плавающим антителам.

После этого колонку промывают PBS-буфером и собирают сопряженные наносенсоры. Затем наночастицы готовы к добавлению флуоресцентного красителя, обеспечивая второй ключевой модальность, используемую для обнаружения. Одной из важнейших особенностей нашего наносенсора является комбинация магнитной и флуоресцентной модальностей, что важно по ряду причин.

Во-первых, комбинация модальностей позволяет каждой из них как бы перепроверять другую, что значительно снижает риск ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что является одним из самых больших препятствий, с которыми сталкиваются различные диагностические платформы, используемые сегодня. Во-вторых, комбинация этих методов значительно расширяет диапазон, в пределах которого мы можем не только обнаруживать, но и количественно оценивать бактериальное загрязнение. Заключительным этапом получения наносенсоров является инкапсуляция флуоресцентного красителя в кодирующую наночастицу.

Это просто достигается путем добавления красителя в раствор во время вортексирования, а затем предоставления дополнительного времени для диффундации красителя в кодировку наносенсора. Затем полностью функционализированные наносенсоры подвергаются диализу в последний раз для очистки. Чтобы охарактеризовать наносенсоры, размер и флуоресцентное представление регистрируются с помощью зетазайзера и считывателя флуоресцентных пластин

Небольшой образец наносенсора добавляют в водный раствор кюветы и помещают в зетазер для записи размера. Для флуоресцентного анализа образец наносенсора помещают на 96-луночный планшет и вставляют в считыватель флуоресцентных планшетов. В идеале наносенсоры должны быть около 70 нанометров в диаметре и иметь флуоресцентную подачу 575 нанометров.

В дополнение к синтезу наносенсоров, культивирование бактерий необходимо для получения бактериальных мишеней в лаборатории. Глицериновый запас бактерий используется для приготовления культуры в питательном бульоне. Затем этому раствору дают инкубироваться.

После начального инкубационного периода проводятся серийные разведения с целью достижения широкого диапазона концентраций бактерий. Сто микролитров каждой концентрации набрасываются на питательную шнековую пластину и затем инкубируются в течение 24 часов. После этой инкубации колонии на каждой пластине подсчитываются для определения колониеобразующей единицы, или количества КОЕ на миллион каждого разведенного запаса.

Теперь, когда бактериальные исходные растворы приготовлены, их можно использовать в сочетании с подготовленными наносенсорами. И один важный аспект этого конкретного серотипа бактерий, который отличает его от других серотипов, заключается в том, что если вы заражаетесь другими серотипами, вам нужно иметь много колониеобразующих единиц, чтобы получить инфекцию. Но в данном конкретном случае E.coli достаточно от 10 до 100 КОЕ или колониеобразующих единиц, чтобы заразить вас инфекцией.

Наша технология построена таким образом, что вы не пропустите ни одной колонии бактериального загрязнения. Чтобы приготовить растворы для считывания показаний в магнитном релаксометре, 300 микролитров PBS сначала пипетируют в трубку Эппендорфа. Затем добавляется образец бактериального сырья с последующим добавлением наносенсоров.

Затем раствор переливают в стеклянную трубку, а сверху кладут кусок парапленки для того, чтобы предотвратить испарение. Затем стеклянная трубка помещается внутрь более крупной ЯМР-трубки и вставляется в магнитный релаксометр. Исходный раствор, не содержащий бактерий и только наносенсор и PBS, используется для получения базового показателя T2, как показано на рисунке.

Затем растворы, содержащие различные концентрации бактерий, вводятся в магнитный релаксометр для анализа, а изменение значений Т2 вызвано связыванием между наносенсорами и бактериями. Как показано, наличие всего одного бактериального КОЕ может быть обнаружено в течение нескольких минут с помощью этого метода. Однако по мере увеличения концентрации бактерий показания МРТ становятся менее поддающимися количественной оценке, поэтому использование данных флуоресцентной субэмиссии также равносильно точной количественной оценке бактерий.

Перед сбором флуоресцентных данных образец необходимо центрифугировать. Раствор переносится из стеклянной пробирки в пробирку Eppendorf, а затем центрифугируется. Это отделяет бактерии и связанные с ними наносенсоры от свободно плавающих наносенсоров в растворе.

Надосадочная жидкость отбрасывается, а бактериальная гранула ресуспендируется в PBS. Наконец, образец может быть проанализирован с помощью флуоресцентной подачи. Сила излучения будет зависеть от количества наносенсоров, оставшихся в растворе, и, следовательно, также от количества присутствующих бактерий.

Как видно, флуоресцентное подчинение усиливается по мере увеличения концентрации бактерий, а также становится более чувствительным. Вот почему сочетание магнитного и флуоресцентного модальностей позволяет обнаруживать и количественно оценивать бактериальное загрязнение как на ранних, так и на поздних стадиях развития. В дополнение к обнаружению бактерий в простых решениях, таких как PBS, эти наносенсоры также обладают способностью работать в более сложных средах, таких как озерная вода или молоко.

Кроме того, эти наносенсоры были протестированы на специфичность в присутствии нецелевых бактерий и инактивированных при нагревании целевых бактерий. Как показано, магнитофлуоресцентные наносенсоры практически не реагируют с нецелевыми или неживыми бактериями из-за специфичности конъюгированных антител. Это демонстрирует их эффективность для обнаружения специфических бактерий в присутствии других видов.

Наконец, также важно отметить, что эти наносенсоры могут быть легко настроены для обнаружения других патогенов. Вы можете синтезировать или сформулировать эти наносенсоры, что мы и сделали в нашей лаборатории в течение месяца. Вы можете сделать это в течение одного месяца, и этот один месяц продукта может дать вам около 10 лет применения.