Жить клеточной измерение одоранта рецептор активации с помощью реального времени лагеря Assay

Общая цель данного высокопроизводительного анализа циклического АМФ в режиме реального времени заключается в скрининге одорантов на соответствие одорантным рецепторам и наоборот. Использование мышей полезно для изучения функционирования одорантных рецепторов, так как это позволяет проводить более масштабный скрининг как самих рецепторов, так и их лигандов, а также фармакологическую характеристику интересующих пар рецептор-лиганд. Основным преимуществом данного метода является возможность эффективно и надежно оценивать активацию рецепторов одорантами.

Гетерологичная система экспрессии рецепторов одорантов с использованием живых клеток. Начните с наблюдения за клетками Hana3A под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в жизнеспособности клеток и оценить степень конфлюэнтности. Затем аспирируйте всю среду из чашки с клеточной культурой.

Промойте клетки, добавив в планшет 10 milliliters фосфатно-солевого буферного раствора, осторожно перемешав содержимое и аспирировав PBS. Затем добавьте в планшет three milliliters 0.5%trypsin-EDTA. Оставьте трипсин с клетками на одну минуту или до тех пор, пока все клетки не перейдут во взвешенное состояние.

Инактивируйте трипсин, добавив 5 миллилитров MEM с 10% FBS, и перемешайте содержимое пипетированием вверх-вниз, чтобы разбить агрегаты клеточной массы. После подсчета клеток перенесите 2x10⁶ клеток на одну лунку 96-луночного планшета, предназначенного для трансфекции, в пробирку объемом 15 миллилитров. Важно правильно рассчитать количество клеток для высева в 96-луночный планшет, чтобы избежать избыточного роста или недостаточной плотности клеток перед стимуляцией.

Центрифугируйте пробирки при 200 ×g в течение пяти минут. Затем аспирируйте супернатант, не задевая осадок клеток. Добавьте по 6 mL среды без антибиотиков для каждого 96-луночного планшета и несколько раз перемешайте содержимое пипетированием вверх-вниз, не допуская образования пузырьков воздуха, чтобы разбить агрегаты клеточной массы.

Перенесите суспензию клеток в резервуар. С помощью многоканального дозатора внесите по 50 µL клеток в каждую лунку 96-луночного планшета. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C в атмосфере с 5% CO2.

Перед трансфекцией осмотрите высеянные клетки под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в надлежащей степени конфлюэнтности (примерно от 30 до 50% на лунку), после чего верните их в инкубатор. Следуйте инструкциям для строки, помеченной как конструкт «одорант-рецептор», конструктов вспомогательного фактора и варианта конструкта биосенсора цАМФ. Затем приготовьте смесь для плазмидной трансфекции в 500 µL MEM для каждого 96-луночного планшета.

Затем приготовьте смесь для трансфекции, содержащую 18 µL реагента для липидной трансфекции в 500 µL MEM. Смешайте трансфекционную смесь со смесью плазмы путем перемешивания пипеткой. Затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.

После инкубации остановите реакцию, добавив 5 milliliters среды MEM с 10% FBS в смесь для трансфекции. Затем расстелите толстый слой стерильных бумажных полотенец в ламинарном шкафу для культивирования клеток. Из инкубатора достаньте 96-луночный планшет с клетками.

Осторожно и многократно постучите перевернутой планшетом по стопке бумажных полотенец, чтобы среда была полностью поглощена бумажным полотенцем. Перенесите по 50 µL объединенной смеси для трансфекции в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубируйте в течение ночи (от 18 до 24 часов) при 37 °C в атмосфере 5% CO2. Вы можете скорректировать график трансфекции и стимуляции, если в одном эксперименте тестируется более одного 96-луночного планшета, чтобы все планшеты обрабатывались с одинаковыми интервалами трансфекции и воздействия стимуляторов.

Перед стимуляцией осмотрите трансфицированные клетки под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в достижении надлежащей конфлюэнтности от 50 до 80% на лунку, после чего верните их в инкубатор. Затем приготовьте стимулирующую среду, добавив 10 mM HEPES и 5 mM глюкозы в сбалансированный солевой раствор Хэнкса. Разморозьте на льду аликвоты по 55 µL реагента-субстрата для анализа цАМФ в режиме реального времени.

Приготовьте 2% раствор abration, смешав 55 µl реагента субстрата и 2 750 µl стимулирующей среды. Разложив на лабораторном столе толстый слой бумажных полотенец, осторожно и многократно прижмите планшет перевернутой стороной к полотенцам, чтобы среда для трансфекции впиталась в них. Промойте клетки, внеся пипеткой по 50 µl стимулирующей среды в каждую лунку.

Осторожно и многократно выстучите стимулирующую среду из 96-луночного планшета. Пипетируйте 25 µL 2% уравновешивающего раствора в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение двух часов. Перед окончанием времени инкубации разведите размороженные стоковые растворы одорантов до рабочей концентрации в стимулирующей среде.

Перед добавлением одоранта используйте планшетный ридер для измерения хемилюминесценции, чтобы определить базовый уровень люминесценции планшета. Быстро извлеките планшет из ридера и добавьте по 25 µL разведений одоранта в каждую лунку. Затем немедленно начните непрерывное измерение люминесценции всех лунок в течение 20 циклов в течение 30 минут.

379 уникальных ольфакторных рецепторов человека были протестированы с использованием 30 мкМ мускунона с помощью анализа циклического АМФ в режиме реального времени. Цветные блоки вдоль оси X обозначают различные семейства ольфакторных рецепторов человека. Ось Y представляет нормализованную люминесценцию через 30 минут после добавления одоранта, когда ответ положительного контроля достиг максимума.

Представлен ответ OR5AN1. На данном рисунке показаны измерения активации OR5AN1 в режиме реального времени при различных концентрациях мускуна, а также результат отрицательного контроля без добавления одоранта. Стрелка указывает момент времени добавления одоранта.

Здесь представлена кривая зависимости ответа от концентрации OR5AN1 при воздействии мускунона через 30 минут после добавления одоранта. Описанный здесь метод занимает в общей сложности три дня, начиная с подготовки исходного планшета с культурами на первый день. После освоения методики процесс в последний день может быть завершен за три часа для каждого 96-луночного планшета при условии правильного выполнения.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как управлять активацией ольфакторных рецепторов с помощью анализа уровня циклического АМФ для получения и интерпретации результатов.