Жить клеточной измерение одоранта рецептор активации с помощью реального времени лагеря Assay

Общая цель этого высокопроизводительного циклического анализа АМФ в режиме реального времени заключается в скрининге одорантов против рецепторов запаха и наоборот. Поскольку мыши полезны для исследования функционирования рецепторов запаха, это позволяет проводить более масштабный скрининг как рецепторов запаха, так и лигандов, а также фармакологические картелизации пар рецептор-лиганд, представляющих интерес. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем эффективно и надежно оценить активацию одоранта в рецептор.

Гетерологичная система экспрессии запаха к рецептору с использованием живых клеток. Начните с наблюдения за клетками Hana3A под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в жизнеспособности клеток и оценить их слияние. Затем аспирируйте всю среду из чашки для культивирования клеток.

И промойте клетки, добавив 10 миллилитров фосфатно-солевого буфера на тарелку, вращая чашку и аспирируя PBS. Затем добавьте на тарелку три миллилитра 0,5% трипсина-ЭДТА. Оставьте трипсин на клетках на одну минуту или пока все клетки не встанут на плаву.

Инактивируйте трипсин, добавив 5 миллилитров MEM с 10% FBS и пипетируя вверх и вниз, чтобы разбить кусочки клеточной массы. После проведения подсчета клеток перенесите 2x10 на 6-ю клетку на 96-луночный планшет, который будет трансфицирован в 15-миллилитровую трубку. Важно, чтобы вы правильно рассчитали количество клеток, которые должны быть подготовлены на 96-луночном планшете, чтобы избежать чрезмерного или недостаточного роста клеток перед стимуляцией.

Центрифугируйте пробирки при 200-кратном перегрузке в течение пяти минут. А затем аспирировать надосадочную жидкость, не нарушая клеточную палитру. Добавьте шесть миллилитров среды без антибиотиков на каждый 96-луночный планшет и пипетка вверх и вниз, не создавая пузырьков воздуха для разрушения кусков клеточной массы.

Перенесите взвешенные клетки в резервуар. С помощью многоканальной пипетки пипетка вводит по 50 микролитров клеток в каждую лунку из 96-луночных планшетов. Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Перед трансфекцией наблюдайте за пластинчатыми клетками под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в правильном слиянии примерно от 30 до 50% на лунку, а затем возвращайте в инкубатор. Следуйте строке с тегами «Одорант-рецепторная конструкция», «Конструкция вспомогательного фактора» и «Вариант варианта циклического биосенсора АМФ». Затем готовят плазменную трансфекционную смесь в 500 микролитрах МЭМ для каждого 96-луночного планшета.

Далее готовят трансфекционную смесь, содержащую 18 микролитров липид-опосредованного реагента для трансфекции в 500 микролитрах МЭМ. Смешайте трансфекционную смесь со смесью плазмы путем пипетирования вверх и вниз. Затем выдерживают при комнатной температуре в течение 15 минут.

После инкубации остановите реакцию, добавив в трансфекционную смесь 5 миллилитров MEM с 10% FBS. Далее расстелите толстый слой стерильных бумажных полотенец в капюшоне для клеточных культур. Возьмите 96-луночный планшет с ячейками из инкубатора.

Аккуратно и многократно постучите тарелкой вверх дном по стопке бумажных полотенец так, чтобы среда полностью впиталась бумажным полотенцем. Перенесите 50 микролитров комбинированной трансфекционной смеси в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубируйте в течение ночи от 18 до 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Вы можете управлять трансфекцией, и график стимуляции должен сохраняться на приборе для более чем одного 96-луночного планшета, тестируемого в одном эксперименте, так что все пластины зеркально отражаются после одного и того же интервала трансфекции и воздействия дистиллятора.

Перед началом стимуляции наблюдайте за трансфицированными клетками под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в правильном слиянии от 50 до 80% на лунку, прежде чем вернуться в инкубатор. Затем приготовьте стимулирующую среду, добавив 10 миллимолярных куч и пять миллимолярных глюкоз в сбалансированный раствор соли Ганкса. Разморозьте 55 микролитров аллокватов циклического анализа АМФ в реальном времени, реагента субстрата аллокватов на льду.

Приготовьте 2%-ный равномерный раствор, смешав 55 микролитров реагента для субстрата и 2 750 микролитров среды для стимуляции. Расстелив на скамейке толстый слой бумажных полотенец, аккуратно и многократно постучите тарелкой вверх дном по бумажным полотенцам, чтобы трансфекционная среда впиталась бумажными полотенцами. Промойте клетки пипетированием по 50 микролитров стимулирующей среды в каждую лунку.

Аккуратно и многократно вытряхните среду для стимуляции из 96-луночного планшета. Пипеткой нанесите по 25 микролитров 2%-ного эквиллибрационного раствора в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение двух часов. До окончания времени инкубации разбавляют размороженные исходные растворы одоранта до рабочей концентрации и стимуляции среды.

Перед добавлением одоранта используйте считыватель хемилюминесцентных планшетов для измерения уровня базальной люминесценции пластины. Быстро снимите пластину со считывателя тарелок и добавьте в каждую лунку по 25 микролитров разбавлений одоранта. Затем немедленно приступают к непрерывному измерению люминесценции всех лунок в течение 20 циклов в течение 30 минут.

379 уникальных рецепторов запаха человека были проверены на 30 микромолярных мусконусов с использованием циклического анализа АМФ в реальном времени. Цветные блоки по оси X указывают на различные семейства рецепторов запаха и запаха человека. Ось Y представляет собой нормированную люминесценцию через 30 минут после добавления одоранта, когда реакция достигла максимума для положительного контроля.

Указывается ответ OR5AN1. На этом рисунке показаны измерения активации OR5AN1 в режиме реального времени при различных концентрациях мусконуса и результат отрицательного контроля без запаха. Стрелкой указывается временная точка добавления одеранта.

Здесь показана кривая реакции концентрации OR5AN1 против мусконуса через 30 минут после добавления одеранта. Описанный здесь метод занимает в общей сложности три дня, начиная с тарелки с ярусами культуры в первый день. После освоения процесс в последний день может быть завершен за три часа для каждого 96-луночного планшета, если он выполнен правильно.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как управлять активацией одерантных рецепторов с помощью циклического анализа АМФ, чтобы обобщить результаты.