Оптимизированный Hemagglutination Assay ингибирование (HI) поддается гриппа специфические антитела титры
1 декабря 2017 г.
Представлены протоколы описывают, как выполнять пробирного торможение гемагглютинации поддается титры гриппа специфические антитела от образцов сыворотки получателей вакцины против гриппа. Первая проба определяет оптимальный вирусного антигена концентрации гемагглютинации. Вторая проба дает количественную оценку гриппа специфические антитела титры на торможение гемагглютинации.
Общая цель данного анализа торможения гемагглютинации заключается в определении титров антител к конкретным исследуемым вирусам. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области вакцинологии, касающиеся иммунитета, индуцированного вакцинацией, и степени защиты в различных популяциях, а также в разных возрастных и группах пациентов. Основными преимуществами данной методики являются ее точность и возможность быстрого определения титра нейтрализующих антител.
Хотя данный метод позволяет определить титры антител у человека, его также можно применять к другим системам, например, для определения титров антител в сыворотке мыши или в супернатантах культур. Начните с маркировки 96-луночных микротитрационных планшетов соответствующей экспериментальной информацией. Затем установите планшет вертикально и с помощью многоканального дозатора добавьте по 25 µL PBS в каждую лунку, за исключением первой лунки в нижнем заднем ряду титрования.
Добавьте 50 µL свежеприготовленного раствора исследуемого антигена в первую лунку ряда обратного титрования, затем добавьте по 25 µL образцов сыворотки, обработанных RDE, в первые лунки первых десяти рядов. Добавьте 25 µL соответствующей антисыворотки в первую лунку 11-го ряда в качестве положительного контроля. Перенесите по 25 µL из первой лунки каждого ряда в последующие лунки для проведения серийных двухкратных разведений.
Выполните пипетирование вверх-вниз от 10 до 15 раз для каждого этапа разведения, удалив последние 25 µL из последних лунок. Затем добавьте по 25 µL раствора антигена в каждую лунку с первого по одиннадцатый ряд и по 25 µL только PBS в каждую лунку ряда обратного титрования. Осторожно постучите по планшету 10 раз со всех четырех сторон для перемешивания.
Затем накройте планшет и выдержите в течение 30 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации добавьте по 50 µl раствора эритроцитов в каждую лунку и перемешайте содержимое планшета, снова аккуратно постукивая по нему. Затем снова накройте планшет и инкубируйте эритроциты в соответствии с используемым видом, как указано в таблице.
После добавления эритроцитов в планшет соблюдайте время инкубации, соответствующее типу крови, используемой в анализе. Слишком короткая или слишком длительная инкубация приведет к неправильной интерпретации результатов. По завершении инкубации оцените гемагглютинацию, наклонив планшет на 90 градусов на 25 секунд, и отметьте результаты для каждой лунки на распечатанной схеме 96-луночного планшета, пока планшет все еще наклонен.
В данном эксперименте оценивали антительный ответ, индуцированный вакцинацией, у 26 здоровых добровольцев, которые перед началом сезона гриппа 2015 года получили инактивированную трехвалентную вакцину против гриппа, содержащую штаммы influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 и B/Massachusetts/O2/2012. Наблюдался перекрестный иммунный ответ на штаммы вирусов A/H3N2/Switzerland/2013 и A/H3N2/Texas/2012, при этом геометрическая средняя величина титров ингибирования гемагглютинации и индуцированная серопротекция против influenza A/H3N2/Switzerland/2013 были значительно ниже по сравнению с influenza A/H3N2/Texas/2012. После вакцинации титры антител к обоим штаммам увеличились, несмотря на то, что штамм A/H3N2/Switzerland/2013 отсутствовал в составе вакцины.
Вирусный гемагглютинин проявляет видозависимую способность к гемагглютинации эритроцитов. Примечательно, что кровь морской свинки не подвергается надлежащей гемагглютинации вирусом гриппа B, а кровь индейки обладает потенциалом к гемагглютинации с высокими титрами и низкой перекрестной реактивностью. После освоения эта методика может быть выполнена за три часа при условии соблюдения всех правил проведения.
При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости обработки сыворотки RDE для инактивации любых неспецифических ингибиторов и предотвращения неспецифического связывания во время гемагглютинации вируса. После применения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как ELISA, для получения дополнительных ответов на вопросы о роли отдельных специфических иммуноглобулинов к патогену. После своей разработки эта методика открыла исследователям в области вирусной иммунологии путь к более глубокому пониманию вакцинального иммунитета у здоровых пациентов и пациентов с иммунодефицитом различных возрастных групп.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить анализ торможения гемагглютинации для количественного определения титров антител, специфичных к определенным штаммам гриппа, в крупном масштабе. Не забывайте, что работа с вирусными антигенами, кровью животных и образцами сыворотки крови человека может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как работа в лаборатории уровня биобезопасности BSL2.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены протоколы проведения анализа торможения гемагглютинации для количественного определения титра антител к вирусу гриппа в образцах сыворотки. Этот метод имеет решающее значение для понимания вакциноопосредованного иммунитета в различных популяциях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вакцинология
- Иммунология
- Серология
Теоретическое введение
- Тест на ингибирование гемагглютинации позволяет измерить антительный ответ на грипп.
- Он дает представление об эффективности вакцин и популяционном иммунитете.
- Данный метод может быть применен к различным типам образцов, включая сыворотки человека и мыши.
- Определение титров антител необходимо для оценки эффективности вакцин.
Цель исследования
- Для количественного определения титров антител к вирусу гриппа у вакцинированных лиц.
- Для оценки иммунного ответа в различных демографических группах.
- Для обеспечения быстрого и точного метода определения титров.
Используемые методы
- Маркировка 96-луночных микротитрационных планшетов с указанием экспериментальной информации.
- Использование многоканального дозатора для внесения PBS в лунки.
- Проведение реакции гемагглютинации для определения оптимальных концентраций вирусного антигена.
- Проведение реакции торможения гемагглютинации для количественного определения титров антител.
Основные результаты
- Анализ позволяет точно определить титры антител к вирусу гриппа.
- Он подтверждает наличие нейтрализующих антител в образцах сыворотки.
- Результаты могут быть использованы при разработке вакцин и стратегий в области общественного здравоохранения.
- Метод adaptable для различных типов образцов и популяций.
Выводы
- Реакция торможения гемагглютинации является надежным инструментом для измерения иммунного ответа.
- Данный метод позволяет глубже понять механизмы иммунитета, индуцированного вакцинацией.
- В дальнейшем метод может быть применен для изучения других вирусных инфекций и различных групп населения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точное количественное определение титров специфических антител к вирусу гриппа имеет важное значение для оценки иммунитета, индуцированного вакцинацией, и проведения анализа иммуногенности в ходе доклинических и клинических исследований. Тест на ингибирование гемагглютинации (РГЦ) представляет собой стандартизированный экспресс-метод измерения ответов нейтрализующих антител в различных популяциях, что позволяет принимать обоснованные решения о целесообразности дальнейшей разработки вакцин. Благодаря возможности анализа перекрестной реактивности между штаммами и оптимизации использования эритроцитов конкретных видов, данный анализ повышает прогностическую достоверность в исследованиях по трансляционной иммунологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать иммунные ответы, индуцированные вакцинами, путем количественного определения титров штаммоспецифических антител, что способствует механистическому снижению рисков при выборе антигенных мишеней.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию гемагглютинина как ключевого антигена гриппа посредством ингибирования вирусной агглютинации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Стандартизация концентраций антигена посредством титрования методом гемагглютинации (ГА), что обеспечивает воспроизводимость исходных данных для последующего скрининга методом РГА.
- Практическая ценность: Обеспечение возможности высокопроизводительного скрининга сывороток с использованием последовательных двукратных разведений в 96-луночном формате, что повышает масштабируемость анализа.
- Научная ценность: Минимизация перекрестной реактивности за счет эмпирического подбора эритроцитов животных (например, морской свинки, индейки), что повышает специфичность анализа для вируса гриппа B и гетерологичных штаммов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет измерить вызванную вакцинацией серопротекцию и средние геометрические титры (GMT) в группах здоровых добровольцев, предоставляя трансляционные биомаркеры иммуногенности.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность кросс-функционального сравнения иммунных ответов в различных возрастных группах и популяциях пациентов с использованием стандартизированных пороговых значений титров.
- Научная ценность: позволяет выявить перекрестные иммунные ответы на невирусные штаммы (например, A/H3N2/Switzerland/2013), что дает информацию для разработки вакцин широкого спектра действия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Анализ РГА вписывается в общий процесс изучения иммуногенности — от ранних этапов поиска до доклинической валидации, предоставляя количественные данные об антителах, которые используются при выборе антигена, оптимизации адъювантов и определении диапазона дозировок.
- Фундаментальная биология: поддерживает проверку гипотез об эффективности вакцин путем измерения функционального ингибирования гемагглютинации антителами.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные о титрах при использовании серийных разведений, что позволяет надежно оценивать соединения или кандидаты в вакцины.
- Аналитика: позволяет получать конечные титры и средние геометрические значения для статистического сравнения иммунного ответа в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом путем оценки иммуногенности на животных моделях (например, в сыворотке мышей) перед началом клинических испытаний на людях.
- Корпоративное использование: создает стандартизированную серологическую платформу, применимую к нескольким штаммам гриппа и форматам вакцин.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую уверенность в иммунитете, индуцированном вакциной, путем измерения титров нейтрализующих антител как коррелята защиты.
- Операционная ценность: Гарантирует воспроизводимость анализа за счет стандартизированной подготовки антигена, использования сыворотки, обработанной RDE, и видоспецифичного времени инкубации эритроцитов.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет раннего выявления недостаточной иммуногенности, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов в вакцины с учетом рисков на основе широты титров к различным штаммам и показателей серопротекции.
Рекомендации по реализации
- Требуются экспертные знания в области вирусологии и серологии для работы с вирусными антигенами, подготовки сыворотки, обработанной RDE, и интерпретации конечных точек гемагглютинации.
- Зависимость от наличия доступа к лабораториям уровня BSL2 для безопасного обращения с вирусами гриппа и кровью человека или животных.
- Необходима стандартизация источников эритроцитов (например, морской свинки, индейки, человека группы O) для минимизации перекрестной реактивности и обеспечения видоспецифической агглютинации.
- Требуется точный контроль времени инкубации эритроцитов во избежание ложноотрицательных или ложноположительных результатов гемагглютинации.
- Возможности метода ограничены измерением функциональной активности антител; он не позволяет количественно определить ненейтрализующие или нефункциональные классы иммуноглобулинов без использования дополнительных анализов (например, ELISA).
