ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы благодарят Drs. Джим Lah и Аллан Levey, Эмори Кафедра неврологии, за полезные замечания и предложения. Эта работа частично финансируется путем ускорения медицины партнерство гранта (U01AG046161-02), Emory Альцгеймера болезнь научно-исследовательский центр (P50AG025688) и Национальный институт по проблемам старения предоставить (R01AG053960-01) N.T.S. Это исследование было также поддержано в невропатологии ядро Эмори неврологии NINDS основной зал Грант, P30NS055077.

этика заявление: все ткани мозга были получены от Emory Alzheimer &#39; s болезни исследовательский центр (АЦСБ) мозга банк. Посмертный тканях человека были приобретены по протоколам надлежащего институционального обзора Совет (IRB).
 1. гомогенизации и фракционирование <ol><li>ткани выбор Примечание: замороженные ткани посмертных лобной коры от здорового управления (Ctl) и патологически подтвержденных случаев AD были отобраны из Эмори АЦСБ мозга банк (n = 2). Посмертные патологического оценки распределения амилоида доска была выполнена согласно консорциуму по созданию реестра для болезни Альцгеймера &#39; s болезни полуколичественного забил 24 критерии, хотя в соответствии с промежуточной системы Браак оценивали нейрофибриллярных клубок патологии. 16 <ol><li>получить замороженные посмертных мозговой ткани от здорового управления (Ctl) и патологически подтвержденных случаях AD. Использование контейнеров сухого льда, щипцы и лезвие бритвы, акцизный ~ 250 мг части серого вещества от каждого образца ткани на тарированного одноразовые весят лодки, заботясь, чтобы предотвратить ткани от таяния. Запишите вес каждый кусок, чтобы быть гомогенизированный.</li>
		<li>Акцизных ~ 250 мг серого вещества, с помощью щипцов и бритвы проверив визуально найти взаимосвязь между внешней серого вещества и внутренний белого вещества. Избегайте белого вещества и что более важно, любой крупных кровеносных сосудов или кровавый регионов, мозговые оболочки или паутинной. Держите ткани, заморожен во время процесса резки, работает быстро и часто поместив весом лодка с ткани мозга в полистирола контейнеров с сухим ice.</li>
		<li>Запись точный вес иссечена от каждого замороженный кусок, используя аналитический баланс серого вещества. Рассчитать объем буфера (LS) с низкой концентрацией соли (см. таблицу 1) необходимые для гомогенизации dounce (5 мл/г или 20% w/v).</li>
		<li>Подготовка 10 мл LS буфер с 1 x ингибитор протеазы и фосфатазы коктейль и холод на ДВС.</li>
		<li>Удалить весил ткани и весом лодка из сухого льда и кости на примерно 2 x 2 мм куски, как он тает. Передача в 2-мл пробирку гомогенизатор предварительно охлажденные dounce на льду</li>
		<li>Добавить 5 мл/г (20% w/v) буфера ледяной с низкой концентрацией соли (LS) с 1 X коктейль АБС битор протеазы и фосфатазы.</li>
		<li>Homogenize ткани мозга на льду, используя примерно 10 ударов высокой Распродажа пестик и 15 ударов низкой Распродажа пестика б.</li>
		<li>Передачи всех огневки до 2 мл полипропиленовые трубы, с помощью стеклянной пипетки Пастера. Этикетке трубки с &#8220; й &#8221; (общая огневки), ткани дело номер и огневки тома. Алиготе 0,8 мл в меткой 1,5 мл трубку. Любой избыток огневки может быть аналогично aliquoted и хранятся в -80 ° C.</li>
		<li>Для каждого 0,8 мл аликвота, добавьте 100 мкл 5 М NaCl и 10% (w/v) sarkosyl в концентрации 0,5 М и 1% w/v, соответственно. Mix трубы хорошо инверсии и инкубировать на льду 15 мин метки трубы с &#34; TH-S &#34; (общая огневки-Sarkosyl) для обозначения, что гомогенатах находятся в sarkosyl буфера (Таблица 1).</li>
		<li>Sonicate каждая трубка для трех 5 s импульсов на 30% амплитуды на льду (максимальная интенсивность = 40%) с помощью зонда microtip.</li> <li>определить концентрацию белка гомогенатах, используя bicinchoninic кислоты (BCA) пробирного 25 метод. 
		Примечание: Средняя белка концентрацию гомогенатах TH-S, подготовленных в 5 мл LS в грамм ткани — 15-20 мг/мл. Может быть фракционированный немедленно или температуре-80 ° C до использования гомогенатах.</li>
		<li>Развести TH-S гомогенатах до 10 мг/мл, с 1 x ингибиторы протеазы и фосфатазы ледяной Сарк буфера (Таблица 1).</li>
		<li>Передачи 5 мг белка (0,5 мл) каждого TH-S огневки в 500 мкл поликарбоната ультрацентрифуга трубы и пара баланс с Сарк буфера. Загрузить трубы в предварительно охлажденные ротора и ультрацентрифугирования на 180 000 x г за 30 мин при 4 ° C. передачи sarkosyl растворимые supernatants (S1) для 1.5 мл пробирок и хранить на -80 ° C. 
		Примечание: (Необязательно мыть) добавить 200 мкл Сарк-буфера ультрацентрифуга трубок, содержащих моющих средств нерастворимые дроби (P1) и выбить окатышей (P1) от нижней части ультрацентрифуга трубок с помощью кончика пипетки 200 мкл.</li>
		<li>Кратко пульс спин перевернутое трубы для 2-3 s (&#8804; 2500 x g) на microcentrifuge передать окатышей (P1) и буфер для 1.5 мл пробирок ниже. Ресуспензируйте нерастворимых окатышей (P1) в буфере Сарк, закупорить вверх и вниз, чтобы гранулы нарушается.</li>
		<li>Пара баланс и центрифуги на 180 000 x g для дополнительных 30 мин при 4 ° C.</li>
		<li>Отменить необязательные мыть супернатант (S2) и проинкубируйте sarkosyl нерастворимые окатышей (P2) в 50-75 мкл буфера мочевины (Таблица 1) с 1 x ПОС (протеазы и фосфатазы ингибитор коктейль) за 30 мин при комнатной температуре чтобы солюбилизировать последнего Пелле. 
		Примечание: Теплый мочевины буфер к комнатной температуре перед использованием, чтобы избежать осадки SDS. Для приложений, чувствительных моющего средства, опустить SDS из буфера мочевины и рассмотреть мытье нерастворимых Пелле (P2) в низкой соли буфера перед resuspending в буфере мочевины.</li>
		<li>Передачи ресуспензированы гранулы (P2) до 0,5 мл пробирок и использовать краткий (1 s) microtip sonication на 20% амплитуды (максимальная интенсивность = 40%) чтобы полностью солюбилизировать последнего гранулы.</li>
		<li>Определяют концентрацию белка sarkosyl растворимые (S1) и - нерастворимые фракций (P2), с использованием BCA пробирного метод. Использовать эти фракции сразу или хранить при температуре-80 ° C до использования.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>, Западный blotting Примечание: Западный blotting была выполнена согласно сообщалось ранее процедуры с незначительными изменениями. 5 , 10 <ol><li>подготовить 40 мкг образцы всего гомогенатах (TH-S), Сарк растворимые (S1) и Сарк нерастворимые (P2) фракций в 1 X Лэмли SDS-page буфере выборки с 5 мм TCEP pH 7. Проинкубируйте образцы на 95 ° C за 5 мин</li>
		Образцы <li>нагрузки на сборный 4-12% 10-Ну бис-трис SDS-PAGE гель. Electrophorese 80 V первый сантиметр (10 мин) и 120 V на оставшуюся (60 мин) или до тех пор, пока краска отслеживания достигает нижней части геля.</li>
		<li>Использовать свежий лезвие бритвы и гель нож Сплит-открыть кассетный сборного гель. Аккуратно отрезать Расчески и самой нижней части гель с лезвием бритвы свежий.</li>
		<li>Ресуспензируйте нерастворимых окатышей (P1) в 200 мкл Сарк буфер с 1 x ПОС, закупорить вверх и вниз.</li>
		<li>Передачи на нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм, с помощью метода сухой передачи на blotting машине (см. таблицу материалы).</li>
		<li>Блокирует мембраны в блокирующем буфере (BB) без анимации 20 30 мин, затем с BB с 0,05% Tween-20 (BB/T) за 30 мин. После блокирования, Промойте мембрану в TBS/T (0,1% анимации 20) на 5 минут, чтобы удалить избыток блокирующий буфер.</li>
		<li>Подготовка 1:1,000 разведений первичных антител pT231, Тау-2 (Пан Тау), AT8 и ЕЕА1 в BB/T (анимации 20 0,05%).</li>
		<li>Инкубации мембран в раствор первичных антител на ночь при 4 ° C с круговой агитации. Промойте мембрану в TBS/T для 3 x 15 мин</li>
		<li>Зонд мембраны с топографической разрежения дневно меченых вблизи IR вторичные антитела в BB/T 60 мин при комнатной температуре в темноте на шейкер. Промойте мембрану 3 x 10 мин в TBS/T и 2 x 5 мин в TBS.</li>
		<li>Проверять мембрану с помощью инфракрасной системы на длине волны возбуждения соответствующую (например 700 Нм (красный канал) для инфракрасного краситель 680 коза анти мыши IgG (H + L) среднего и 800 Нм (зеленый канал) для инфракрасного краситель 790 осла анти кролик IgG (H + L вторичные)).</li>
		<li>Использование изображений программное обеспечение для количественного определения интенсивности сигнала и выполнять замеры денситометрия согласно производителя &#39; s инструкции, обеспечение auto фоновый параметр равным средний весь фон.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991(1991).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li>
<li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyloid+Beta+Peptide%3A+A+Chemist%27s+Perspective.+Role+in+Alzheimer%27s+and+Fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li>
<li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li>
<li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer%27s+Disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li>
<li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJulien%2C+C+%22Amyloid+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22">Amyloid Proteins: Methods and Protocols</a>. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).</li>
<li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).</li>
<li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li>
<li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility%2C+including+A%CE%B2+but+not+tau%2C+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li>
<li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+%CE%B1-Synuclein+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+%CE%B1-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+%CE%B1-Synucleinopathy+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130(2006).</li>
<li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/29/1_Supplement/712.3">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1759558">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived%2C+Toxic%2C+High+Mass+Amyloid+%CE%B2-Protein+%28A%CE%B2%29+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+%CE%B2-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li>
<li>Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+%28snRNPs%29+aggregate+in+Alzheimer%27s+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).</li>
<li>Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+change%2C+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li>
<li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer%27s+Disease+%28CERAD%29.+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer%27s+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li>
<li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subfraction+of+A%CE%B2+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Здесь мы представляем и обсудить сокращенное одноступенчатых моющих средств фракционирование протокол, который применяется для широкого ряда экспериментальных приложений, начиная от массы на основе спектрометрии протеомики анализа функциональных белков сворачиванию анализов и Западный blotting. 5 , 6 , 7 , 10 данная методология, пожалуй, наиболее эффективным при использовании для изучения нейро...

Нейродегенеративные заболевания, как болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезни Гентингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и тесно связанных прионных заболеваний являются proteinopathies, характеризуется постепенным накоплением агрегатов моющего средства нерастворимого белка в головном мозге с сопутствующими когнитивных снижаться. 1 , 2 считается, что эта общая патологическая функция играть центральную роль в этиологии и патофизиологии этих нейродегенеративных заболеваний. 2 эти агрегаты обычно состоят из полимерных волокон амилоида, которые состоят из повторяющихся звеньев смятых протеинов экспонирования крест β-структуры. 1 , 2 , 3 , 4 биохимически, амилоида агрегаты обладают высокой устойчивостью к химическим или тепловой денатурации и солюбилизация,3 , который представляет уникальные проблемы для их очистки, анализ и исследование через традиционные биохимические методы. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 неудивительно, что моющее средство нерастворимые белковые фракции был в центре внимания многочисленных исследований в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний, связанных с накоплением смятых протеинов. 6 , 12 , 13 , 14
Фракционирование биохимические методы часто были использованы для обогатить моющих средств нерастворимые фракция от гомогенатах мозга посмертных. 6 , 12 , 13 , 14 один из наиболее распространенных методов предполагает последовательное извлечение гомогенатах ткани с буферами и моющих средств увеличения жесткости, а затем ultracentrifugation для разделения фракций растворимых и нерастворимых. Часто используемых последовательных фракционирование протокола6,14 включает гомогенизацию образцов замороженные ткани в буфере моющее средство бесплатно низкой концентрацией соли (LS) и затем результирующая нерастворимых гранулы последовательно извлекаются с буферы содержащие высокий соль, неионогенные моющих средств, высоким сахарозы, ионные моющих средств и, наконец, chaotropes как мочевины. 6 , 14 очевидный недостаток такого последовательного фракционирование протоколов является значительное количество времени и труда обязательства, необходимые для их завершения. Включая гомогенизации и ultracentrifugation, типичный пятиступенчатый фракционирование протокол может занять несколько часов или даже дней для завершения. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 , Кроме того, как много патологического белка агрегатов остаются нерастворимых в всех исклучая суровых условий19,20 большинство созданных фракций имеют ограниченную ценность. Таким образом менее строгие фракционирование шаги, используя высокие концентрации соли и неионных моющих средств являются значительной степени излишним.
Предыдущие исследования показали, что ионные моющее N-лаурил sarcosine (sarkosyl) является отличным кандидатом для упрощенной одноступенчатых стиральный порошок фракционирование протокола. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 как денатурируя моющего средства sarkosyl является достаточно строгим, чтобы солюбилизировать последнего подавляющее большинство изначально сложенном белков в мозге без растворяющие смятых протеинов агрегатов состоит из бета амилоида (значения),6,11 фосфорилированных Тау (pTau),6 TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43),14 альфа synuclein,12,13 почесуха,23 или U1 малых ядерных ribonucleoproteins (U1 snRNPs) например U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Как sarkosyl является менее строгим, чем вездесущие анионные стиральный порошок натрия лаурилсульфат (SDS), она сохраняет менее надежные олигомерных формы агрегатов смятых протеинов, которые не могут выдержать SDS лечения. 9
Ранее мы описали сокращенное моющих средств фракционирование протокол, который достигнутые результаты, сопоставимые с более трудоемкий последовательных фракционирование методологий. 5 , опустив менее жесткие шаги фракционирования, мы смогли разработать протокол снисходительный одноступенчатых фракционирование для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от посмертных человеческого мозга. 5 этот подробный протокол, описанные здесь хорошо подходит для широкого круга экспериментальных приложений, начиная от Западный blotting и массы на основе спектрометрии протеомики к сворачиванию функциональных белков и агрегации посева assays. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Коктейль ингибиторов протеазы и фосфатазы, без ЭДТА (100X)</td><td>Коктейль протеаз и ингибиторов фосфатазы</td> <td>Thermo Fisher</td><td>78441</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (ультразвуковой аппарат)</td><td>Ультразвуковой аппарат Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>микронаконечником Ультрацентрифуга</td></tr><tr><td>Optimax TLX Beckman</td><td>Coulter</td><td>361545</td><td>охлаждаемая ультрацентрифуга</td></tr><tr><td>TLA120.1 ротор</td><td>Beckman Coulter</td><td>362224</td><td>ультрацентрифуга ротор</td></tr><tr><td>500 мкл (8 x 34 мм) поликарбонатные трубки, толстостенные</td><td></td> ультрацентрифужные пробирки <td>Beckman Coulter</td> 343776 <td>ультрацентрифуги для ротора TLA120.1</td></tr><tr><td>4X SDS буфер для образцов</td><td>Домашний</td><td>Н/Д</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP раствор, нейтральный pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td></td></tr> <tr><td>восстановитель (TBS) блокирующий буфер</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>блокирующий буфер</td></tr> <tr><td>(TBS) блокирующий буфер + 0,05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>блокирующий буфер и разбавитель антител</td></tr><tr><td>4-12% гели Bolt Bis-Tris Plus, 10-луночный</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>сборный гели SDS-PAGE</td></tr><tr><td>MES SDS Беговой буфер (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE беговой</td></tr><tr><td>буфер N-лауроилсаркозин натриевая соль (саркозил)</td><td>Sigma Олдрич</td><td>L5777-50G</td><td>моющее средство</td></tr><tr><td>Антитела против тау-2 (пантау)</td><td>антитела Chemicon</td><td>MAB375</td><td>Антитела</td></tr><tr><td>против фосфо-треонина 231 Тау Антитела</td><td>Миллипоры</td><td>MAB5450</td><td></td></tr><tr><td>Антитела против фосфо-сероина 202 и треонина 205 Тау-антитела (AT8)</td><td>Антитела Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>Антитела против раннего эндосомного антигена 1 (EEA1) abcam</td><td></td><td>ab2900</td><td>антитела</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 козы против мыши IgG (H+L) вторичное антитело</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>антитела</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 ослик против кролика IgG (H+L) вторичное антитело</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>антитела</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>гель трансфер</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, нитроцеллюлоза, мини</td><td>Перенос Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Gel</td></tr></tbody></table>

Обогащение моющего средства нерастворимого белка агрегатов от мозга человека посмертный

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

В этом исследовании мы описываем сокращенное одноступенчатых фракционирование протокол для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от человека посмертных мозг. Ионных моющее N-лаурил sarcosine (sarkosyl) эффективно solubilizes изначально сложенном белков в ткани мозга, позволяя обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от широкий спектр нейродегенеративных proteinopathies, такие как Болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз и прионы заболеваний. Человеческого контроля и AD посмертных мозга тканей были гомогенизированные и осевших ultracentrifugation присутствии sarkosyl обогатить моющего средства нерастворимого белка агрегаты, включая патологическое фосфорилированных Тау, основной компонент нейрофибриллярных связок в AD. Западный blotting продемонстрировал дифференциального растворимость агрегированных фосфорилированных Тау и моющих средств растворимого белка, раннего Endosome Antigen 1 (ЕЕА1) управления и AD мозга. Протеомного анализа также выявлено обогащение β-амилоида (значения), Тау, snRNP70 (U1 - 70 K) и аполипопротеина Е (АРОЕ) в sarkosyl нерастворимые фракций AD мозга по сравнению с теми из элемента управления, в соответствии с предыдущей стратегии фракционирование ткани . Таким образом этот протокол простого обогащения идеально подходит для широкого круга экспериментальных приложений, начиная от Западный blotting и функциональных белков Сопредседатель агрегации анализов массы на основе спектрометрии протеомики.

Сокращенная сингл шаг sarkosyl фракционирование протокол был использован для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от контроля и AD посмертных мозга (рис. 1). Белки из й-S, S1, S2 и P2 фракций были решены путем SDS-PAGE, фиксированный за 15 мин в Кумасси синий фиксирующие буфера следуют нежный Окрашивание Кумасси синим G-250 окрашивание буфера. Ресуспендирования шаг является необязательным, так как там были неопределяемого уровня белка в ...

Описан сокращенное фракционирование протокол для обогащения моющего средства нерастворимого белка агрегатов от человека посмертных мозг.

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Общая цель данного протокола фракционирования заключается в обогащении проб детергент-нерастворимыми белковыми агрегатами из посмертных тканей головного мозга человека. Таким образом, этот метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области нейродегенерации, такие как идентификация и характеристика неправильно свернутых белковых агрегатов при заболеваниях. Основным преимуществом данной методики является быстрое обогащение и выделение детергент-нерастворимых белковых агрегатов из тканей мозга за короткий промежуток времени.Эту процедуру продемонстрирует Трам Нгуен, техник моей лаборатории. Возьмите замороженные образцы посмертной ткани мозга здорового контроля и пациентов с патологически подтвержденной болезнью Альцгеймера. Используя пинцет и лезвие бритвы, вырежьте порции серого вещества массой примерно 250 mg из каждого образца ткани. Дайте сегменту мозга оттаять в течение одной минуты.Теперь, по мере размораживания, нарежьте фрагмент ткани кубиками размером примерно 2 мм³. Перенесите их в предварительно охлажденную пробирку гомогенизатора Dounce объемом 2 мл на льду. Не забудьте избегать попадания белого вещества и крупных кровеносных сосудов.Работайте быстро и помещайте ткань в одноразовые лодочки для взвешивания с предварительной тарой. Следите за тем, чтобы ткань не оттаяла, часто помещая лодочку с тканью мозга в полистироловые контейнеры с сухим льдом. После препарирования и взвешивания всех необходимых фрагментов ткани извлеките лодочку с фрагментом ткани из сухого льда.Затем добавьте пять миллилитров ледяного низкосолевого буфера с коктейлем ингибиторов протеаз и фосфатаз на один грамм ткани и гомогенизируйте на льду, используя примерно 10 движений пестика A с большим зазором и 15 движений пестика B с малым зазором. Затем с помощью девятидюймовой стеклянной пастеровской пипетки перенесите каждый гомогенат в маркированную полипропиленовую пробирку объемом два миллилитра. Аналогичным образом разлейте оставшийся гомогенат по дополнительным маркированным пробиркам объемом 1,5 миллилитра для хранения при температуре минус 80 °C. Для проведения фракционирования добавьте 100 µL 5 M NaCl и 100 µL 10% саркозила в каждую аликвоту объемом 0,8 миллилитра.Тщательно перемешайте путем инверсии. Затем инкубируйте на льду в течение 15 минут. После инкубации используйте соникатор, оснащенный микрозондом, чтобы подать три пятисекундных импульса с амплитудой 30%.После определения концентрации белка в гомогенатах бицинхониновым методом, добавьте в каждый образец ледяной буфер Sارك с ингибиторами протеаз и фосфатаз до конечной концентрации 10 mg/mL. Затем перенесите 500 µL каждого образца в поликарбонатные пробирки для ультрацентрифугирования объемом 500 µL. Поместите пробирки в предварительно охлажденный ротор и центрифугируйте при 180 000 ×g в течение 30 минут при температуре 4 °C.После центрифугирования перенесите саркозоль-растворимые супернатанты S1 в пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -80 °C. Добавьте 200 µL саркозольного буфера в пробирки для ультрацентрифугирования, содержащие детергент-нерастворимые фракции P1, и с помощью наконечника пипетки отделите осадки от дна пробирок. Затем перенесите ресуспендированные осадки P1 в новые пробирки для ультрацентрифугирования объемом 500 µL, сбалансируйте их попарно и центрифугируйте при 180 000 ×g еще в течение 30 минут при температуре 4 °C.Удалите супернатант S2. Затем добавьте от 50 до 75 µL мочевинного буфера с коктейлем ингибиторов протеаз и фосфатаз к осадкам, нерастворимым в саркозиле, и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре для сольватации осадка P2. После инкубации перенесите ресуспендированные осадки P2 в маркированные пробирки объемом 0,5 мл и полностью растворите их, используя кратковременную односекундную соникацию микрозондом при амплитуде 20%.Определите концентрацию белка в саркозил-растворимой и саркозил-нерастворимой фракциях с помощью метода BCA. Подготовьте образцы общего гомогената, саркозил-растворимой фракции S1 и саркозил-нерастворимой фракции P2 массой 40 µg в 1x буфере для образцов SDS-PAGE по Лэммли с 5 mM TCEP при pH 7. Инкубируйте образцы при 95 °C в течение пяти минут.Нанесите образцы на готовые 10-луночные гели для SDS-PAGE с концентрацией Bis-Tris от 4 до 12%. Проводите электрофорез при 80 В на протяжении первого сантиметра и при 120 В в течение примерно одного часа или до тех пор, пока фронт красителя не достигнет нижней части геля. Погрузите кассеты с готовым гелем в дистиллированную воду, затем с помощью нового лезвия бритвы и специального ножа для гелей аккуратно вскройте их.Осторожно срежьте гребенки и самый низ каждого геля новым лезвием бритвы. Перенесите белки на нитроцеллюлозные мембраны с порами 0.2 микрон, используя метод сухого переноса на установке для блоттинга. После переноса заблокируйте мембраны в блокирующем буфере без Tween-20 в течение 30 минут, затем в блокирующем буфере с 0.5% Tween-20 в течение 30 минут.После блокировки промойте мембраны в TBS с 0,1% Tween-20 в течение пяти минут, чтобы удалить избыток блокирующего буфера. Приготовьте разведения первичных антител 1:1 000 в блокирующем буфере с 0,5% Tween-20. В данной работе используются Phospho-Tau pT231 и EEA1.Инкубируйте мембраны в растворе первичных антител в течение ночи при температуре 4 °C при круговом перемешивании. На следующий день трижды промойте мембраны в буфере TBS с 0,1 % Tween-20 по 15 минут за каждую промывку. Проведите зондирование мембран с использованием вторичных антител с ближним ИК-флуоресцентным маркером в разведении 1:20 000 и блокирующего буфера с 0,5 % Tween-20 в течение 60 минут при комнатной температуре в темноте на шейкере.После инкубации промойте мембрану трижды по 10 минут в TBS с 0,1% Tween-20 и дважды в TBS по пять минут за каждую промывку. Просканируйте мембрану с помощью системы инфракрасной визуализации на соответствующей длине волны возбуждения для используемого вторичного антитела. На этом геле, окрашенном кумасси, показано 20 mcg белка из фракций TH-S, S1, S2 и P2.Вестерн-блот-анализ четко демонстрирует, что в мозге при болезни Альцгеймера патологические высокомолекулярные фосфорилированные агрегаты Tau являются нерастворимыми в саркозиле, и в саркозильных фракциях остается очень мало фосфо-Tau. EEA1 использовался в качестве общего маркера для большинства нативных непатологических белков, которые по своей природе растворимы в саркозиле и распределяются во фракцию S1 как в контрольном мозге, так и в мозге при болезни Альцгеймера. Примечательно, что сигнал EEA1 в растворимой фракции был несколько слабее по сравнению с фракцией TH-S, что указывает на то, что небольшая часть EEA1, вероятно, нерастворима в саркозиле, однако находится ниже предела обнаружения методом вестерн-блота с использованием данного конкретного антитела.На этом рисунке представлен протеомный анализ патологических белков болезни Альцгеймера с использованием протокола одноступенчатого или многоступенчатого фракционирования. Метод одноступенчатого фракционирования может быть более эффективным для белков с низкой концентрацией, так как общие потери образца значительно сокращаются. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости максимально полного удаления белого вещества из ткани головного мозга.После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как протеомика на основе масс-спектрометрии, чтобы идентифицировать и охарактеризовать основные белковые компоненты патологических агрегатов при дегенеративных заболеваниях.

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Биохимия

Сотовые неоднородность ткани головного мозга создает значительные ограничения для изучения эпигенетической маркировки в хроматина, потому что большинство анализов отсутствие одной резолюции клетки. Нейроны обычно идут прямо глии и других не-нервных клеток. Мы предоставляем протокол для извлечения и собирать нейронов ядер от человеческого мозга.

Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные

Мы опишем технику для подготовки уточнил человека корковых гомогенатов разделения белков с помощью ДСН-ПААГ, антиген поиска и иммуноблоттинга с антителами к Ар пептида. Используя этот протокол, мы последовательно обнаружить мономерные и многомерные Ар в ткань коры головного мозга у людей с патологией Альцгеймера.

SDS-PAGE/Immunoblot Обнаружение Ар мультимеров в населенных корковой ткани гомогенатах использованием антиген-эпитопов поиска

Новый вид клеточный белок прион...

Выделение растворимых и нерастворимых олигомеров PrP в нормальном мозга человека

Это видео демонстрирует протокол выделения амилоидных фибрилл из экстракта ткани мозга мыши с использованием центрифугирования градиента плотности и расщепления неамилоидных белков.

Выделение амилоидных фибрилл из экстракта мозговой ткани

Это видео объясняет процесс выделения и обогащения нерастворимых в моющих средствах белковых агрегатов из замороженной посмертной ткани человеческого мозга. В нем демонстрируются ключевые этапы, включая гомогенизацию, обработку моющим средством, ультразвуковую обработку и ультрацентрифугирование для отделения и очистки нерастворимых агрегатов. Заключительный этап включает в себя солюбилизацию агрегатов в буфере мочевины для дальнейшего анализа.

Выделение нерастворимых в детергентах белковых агрегатов из посмертной ткани мозга человека

Протокол добыча общего белка с использованием мочевины / тиомочевины / SDS буфера для человека и мышей мозговой ткани позволяет Идентификация белков по 2D-Dige и их последующей характеристики по мини 2DE иммуноблоттинга. Этот метод позволяет получить более воспроизводимые и надежные результаты от человека биопсии и экспериментальных моделей.

Консенсус мозга, полученных Белок, Добыча протокол по изучению человека и мыши мозга Proteome использованием как 2D-Dige и мини 2DE Иммуноблоттинг

Здесь мы представляем протокол для выделения все более нерастворимого/агрегированного альфа-синуклеина (α-syn) из посмертной ткани мозга человека. С помощью буферов с увеличенной детергентной силой и высокоскоростных методов ультрацентрифугирования можно исследовать переменные свойства агрегации α-syn в больных и небольных тканях.

Последовательное извлечение растворимых и нерастворимых Альфа-синуклеина из Паркинсона Brains

Мы сообщаем о простом, эффективном по времени и высокопроизводительном флуоресцентном спектроскопии анализе для количественной оценки актиновых нитей в биологических образцах ex vivo из тканей мозга грызунов и людей.

Эффективный по времени анализ на основе флуоресцентной спектроскопии для оценки статуса полимеризации актина в тканях мозга грызунов и человека

Этот метод биохимической очистки с протеомным анализом на основе масс-спектрометрии облегчает надежную характеристику амилоидных фибровых ядер, что может ускорить идентификацию мишеней для профилактики болезни Альцгеймера.

Биохимическая очистка и протеомная характеристика амилоидных ядер Фибриля из головного мозга

В данном исследовании изложены экспериментальные методы биохимической характеристики GFAP и его мутаций, вызывающих болезни, с акцентом на сборку, агрегацию и посттрансляционную модификацию филамента. Были проанализированы белки высокой чистоты GFAP, что позволило понять механизмы болезни Александера, которые могут служить основой для изучения потенциальных терапевтических целей и понимания мутаций GFAP и связанных с ними заболеваний.

Экспериментальные подходы к биохимическому анализу глиального фибриллярного кислого белка и его вариантов, связанных с болезнью

Изучите метод фракционирования для обогащения нерастворимых белковых агрегатов из посмертной ткани мозга человека. Этот протокол позволяет быстро выделять агрегаты для исследований нейродегенеративных заболеваний.

Обогащение моющего средства нерастворимого белка агрегатов от мозга человека посмертный

Больше видео