Геномное картирование белково-ДНК-взаимодействий с ChEC-seq in Разное

Общая цель этой процедуры заключается в создании полногеномных карт взаимодействий белка и ДНК in situ с высоким разрешением и низким фоном, без необходимости сшивания формальдегида, солюбилизации хроматина или антител. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области транскрипции, например, где различные регуляторные факторы связаны с хроматином относительно ген-регуляторных областей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает карты связывания генома с высоким разрешением с незначительным фоном и позволяет избежать ограничений, связанных со стандартными протоколами ChEC-seq.

Демонстрировать процедуру будет Себастьян Грюнберг, мой коллега из Онкологического исследовательского центра Фреда Хатчинсона. Во второй половине дня или вечером за день до начала эксперимента начните предварительную культуру штамма для экспериментального использования. Инокулируйте три миллилитра использованной пептон-декстрозы или подходящей селективной среды с одной колонией штамма, несущей фактор, меченный MNase.

Инкубируйте эту культуру в течение ночи в шейкере-инкубаторе с температурой 30 градусов Цельсия. На следующее утро разведите ночную культуру до 50 миллилитров среды до оптической плотности при 600 нанометрах от 0,2 до 0,3. Инкубируйте культуру в шейкер-инкубаторе до тех пор, пока она не достигнет оптической плотности на 600 нанометрах от 0,5 до 0,7.

Приготовьте необходимое количество буфера А плюс добавки, и поддерживайте его комнатную температуру во время процедуры. Подготовьте пробирки с микрофугами для сбора образцов. Для каждого нового анализируемого фактора соберите образцы без добавления кальция и добавьте через 30 секунд, одну минуту, 2,5 минуты, 5 минут и 10 минут после добавления кальция.

В каждую трубку добавьте 90 микролитров стоп-раствора, и 10 микролитров 10%-ного SDS. Когда культура достигнет оптической плотности на уровне 600 нанометров от 0,5 до 0,7, сцедите культуру в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при 1500-кратном g в течение одной минуты при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость, тщательно ресуспендируйте клетки в одном миллилитре буфера А и перенесите ресуспендированные клетки в микрофугальную пробирку.

Гранулируйте ресуспендированные клетки в микрофуге в концентрации 1500 умноженных на г в течение 30 секунд при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость и тщательно ресуспендируйте клетки в одном миллилитре буфера А путем пипетирования вверх и вниз. Гранулируйте ресуспендированные элементы в дозе 1500 раз g в течение 30 секунд при комнатной температуре.

Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре буфера А и снова центрифугируйте. После удаления надосадочной жидкости тщательно ресуспендируйте клетки в 570 микролитрах буфера А. Добавьте 30 микролитров 2% дигитонина, чтобы облегчить проникновение клеток, и перемешайте. Проникните клетки в тепловой блок при температуре 30 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Пипеткой проводите реакцию вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. В качестве отрицательного контроля переложите 100 микролитров аликвоты пермеабилизированных клеток в микропробирку, содержащую стоп-раствор и SDS, и кратковременно перемешайте вихрь. Перед началом течения времени очень важно иметь рядом с нагревательными блоками пробирки с раствором для остановки, пипетку, наконечники для пипеток и таймер, чтобы можно было эффективно собирать ранние временные точки.

Чтобы начать временной курс, добавьте 1,1 микролитра одномолярного хлорида кальция в проникающие клетки для активации МНазы и быстро переверните несколько раз для перемешивания. Сразу же верните перемешанную реакцию до 30 градусов по Цельсию и запустите таймер. В каждой точке времени, которую необходимо собрать, пипеткой проведите реакцию вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, а затем удалите 100 микролитров аликвоты проникнутых клеток в микрофугальную пробирку, содержащую стоп-раствор и SDS.

Вихрь коротко перемешать. После того, как все временные точки будут собраны, добавьте четыре микролитра 20 мг на миллилитр протеиназы К к каждому образцу. Вортекс ненадолго перемешать, и инкубировать при температуре 55 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Добавьте 200 микролитров фенола:хлороформа:изоамилового спирта в каждый образец, энергично перемешайте и центрифугируйте на максимальной скорости в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите водную фазу в новую трубку. Добавьте 30 микрограммов гликогена и 500 миллилитров 100% этанола.

Вихрь энергично перемешать, и высадить на сухом льду в течение 10 минут, или до тех пор, пока раствор не станет вязким. Гранулируйте осажденную ДНК центрифугированием на максимальной скорости и при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут. Сцедите надосадочную жидкость и промойте каждую гранулу одним миллилитром 70%-ного этанола комнатной температуры.

Сцедите этанол и удалите остатки, перевернув и осторожно постучав по трубкам бумажным полотенцам. Кратковременно открутите образцы с помощью настольной центрифуги, затем используйте пипетку для удаления остатков этанола, стараясь не повредить гранулу. Высушите гранулы на воздухе при комнатной температуре в течение пяти минут.

Пока гранулы ДНК высыхают, приготовьте мастер-смесь из трис-буфера и РНКазы А для повторного суспендирования гранул после их высыхания и перемешайте вихрь. Добавьте 30 микролитров раствора РНКазы А в каждую высушенную гранулу ДНК, смешайте и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут, чтобы переварить РНК. Через 20 минут смешайте один микролитр 6-кратного красителя для загрузки ДНК с пятью микролитрами каждого образца и используйте 1,5%-ный агарозный гель при напряжении 120 вольт в течение 40 минут.

Начните процедуру подбора размера с добавления в каждый образец 75 микролитров гранул SPRI в растворе полиэтиленгликоля. Пипеткой вверх и вниз 10 раз смешайте шарики и смесь ДНК, а затем инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Во время инкубации гранул SPRI подготовьте микрофуговые пробирки, содержащие 96 микролитров 10 миллимолярного триса pH 8,0 и четыре микролитра пятимолярного хлорида натрия для каждого образца.

Поместите пробирки, содержащие шарики и смесь ДНК, в магнитный штатив на две минуты, чтобы собрать шарики на боковой стороне пробирки, затем перенесите каждую надосадочную жидкость в новую пробирку, содержащую трис и хлорид натрия. Добавьте 200 микролитров фенола:хлороформа:изоамилового спирта в каждый образец, перемешайте и центрифугируйте на максимальной скорости при комнатной температуре в течение пяти минут. Удалите каждую водную фазу в новую пробирку, добавьте 30 микрограмм гликогена и 500 микролитров 100% этанола.

Осаждение ДНК на сухой лед в течение 10 минут или до тех пор, пока раствор не станет вязким. Гранулируйте осажденную ДНК центрифугированием на максимальной скорости и при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут. Сцедите надосадочную жидкость и промойте каждую гранулу одним миллилитром 70%-ного этанола.

Сцедите этанол, удалив остатки, перевернув и аккуратно постучав по трубкам бумажным полотенцем. Кратковременно открутите образцы с помощью настольной центрифуги и используйте пипетку для удаления остатков этанола, стараясь не повредить гранулу. Высушите гранулы на воздухе при комнатной температуре в течение пяти минут.

Суспендируйте каждую высушенную гранулу в 25 микролитрах Tris pH 8. Определите концентрацию каждого образца с помощью высокочувствительного анализа. Электрофорез ДНК в агарозном геле на основе анализа эндогенного расщепления хроматина Reb1, общего регуляторного фактора, связывающего обедненные нуклеосомами области, показывает кальцийзависимое увеличение фрагментации ДНК с течением времени, о чем свидетельствует размазывание, и возможное полное переваривание геномной ДНК.

Визуализация концов фрагментов, полученных в эксперименте по секвенированию эндогенного расщепления хроматина Reb1, показала надежное обогащение Reb1 на фоне, полученное из свободного штамма MNазы после 30 секунд обработки кальцием. Аналогичным образом, значительное расщепление ДНК наблюдалось при слиянии субъединицы медиатора Med8 с МНазой, но не свободной МНазы, вызванной промотором Med8 через минуту после добавления кальция. Для сравнения данных эндогенного расщепления хроматина Reb1 с данными иммунопреципитации хроматина и секвенирования с высокой пропускной способностью, 1 992 пика Reb1, определенные органическим методом, были центрированы по мотиву, и было определено среднее количество концов фрагментов в каждой позиции основания в окне из 100 пар оснований вокруг средней точки мотива.

Наблюдалась поразительная асимметрия и спайность, при этом большинство концов высвобожденных фрагментов Reb1-MNазы отображались на восходящую сторону мотива. После освоения этой техники ее можно выполнить за один полный рабочий день, если она выполнена правильно. При выполнении этой процедуры важно помнить об ограничении количества образцов, анализируемых параллельно, чтобы обеспечить точное пипетирование и время обработки.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области транскрипции, которые впервые однозначно охарактеризовали геномную ассоциацию белкового комплекса размером мегадальтон, не связывающего ДНК, у дрожжей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять метод ChEC-Seq для полногеномного картирования белок-связывающих сайтов в почковающемся геноме дрожжей.