Нейроповеденческих оценок в мышиной модели неонатальная гипоксически ишемического черепно-мозговой травмы
24 ноября 2017 г.
Мы исполняли односторонних сонной артерии окклюзии на послеродовой день CD 7-10-1 мыши щенков для создания неонатальная гипоксически ишемического (HI) модели и изучается воздействие Привет черепно-мозговой травмы. Мы изучили нейроповеденческие функции в этих мышей, по сравнению с неоперированных обычных мышей.
Общая цель операции по моделированию гипоксически-ишемического поражения мозга новорожденных с последующим когнитивным и моторным тестированием заключается в создании мышиной модели для изучения подобных повреждений и связанного с ними поражения головного мозга. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы о гипоксически-ишемическом поражении мозга новорожденных, например, о том, как такие повреждения влияют на двигательные и когнитивные функции. Основным преимуществом этой методики является ее высокая изученность и широкое применение.
Это также является доклинической моделью детского церебрального паралича и неонатального инсульта. Как правило, специалистам, впервые использующим данный метод, будет трудно работать, так как правую общую сонную артерию сложно идентифицировать. Процедуру вместе со мной будет демонстрировать Юн-Кюм Шин, аспирант нашей лаборатории.
После проведения анестезии как минимум пяти мышат семидневного возраста (P7) поместите одного из них под диссекционный микроскоп брюшком вверх. Затем обработайте область шеи спиртом. Для начала операции с помощью ножниц сделайте разрез длиной 0.7 мм в области шеи.
Затем осторожно удалите жировую ткань с помощью пинцета до обнажения правой общей сонной артерии. Далее перевяжите правую общую сонную артерию швом 5-0. После этого зашейте разрез на шее нейлоновой нитью 5-0 и стерилизуйте место разреза.
Затем дайте щенку восстановиться в гипоксической камере при 37 °C с открытой крышкой в течение примерно одного часа. Поместите в гипоксическую камеру другого мышонка, перенесшего хирургическую манипуляцию, для восстановления. Когда все щенки полностью проснутся, закройте крышку камеры и снизьте уровень газов для создания гипоксических условий.
После 90 минут гипоксии верните щенков с повреждением головного мозга в клетки. Через неделю подготовьте щенков к операции, как и ранее, для поиска признаков повреждения. Сделайте разрез кожи головы, чтобы определить очаг поражения мозга в постеролатеральной области правого полушария.
Осмотрите полупрозрачный череп на наличие признаков повреждения коры головного мозга и гиппокампа. На основании этого распределите щенков по группам: поврежденные или контрольные (неповрежденные). После проверки зашейте кожу скальпа швом и стерилизуйте место разреза.
Когда мышам исполнится шесть недель, оцените их память на основе обучения и избегания неблагоприятного стимула. Для выполнения этой задачи используйте коммерческую установку для пассивного избегания с двумя отсеками и возможностью перехода. Для начала поместите мышь в светлый отсек коробки на 30 секунд.
Затем откройте дверь между отсеками и зафиксируйте латентный период до входа животного в темный отсек. На выполнение задания отводится до 300 секунд. Когда все четыре конечности мыши полностью окажутся в темном отсеке, закройте дверь.
Затем воздействуйте электрическим разрядом силой 1/2 мА на лапки в течение двух секунд и верните мышь в клетку. Через 24 часа повторите тест. В этот раз предоставьте мыши полные 300 секунд для перехода в темную камеру, не подвергая её воздействию разряда.
Проведите тест с лестницей (ladder walking test) на шестинедельных мышах для выявления незначительных нарушений моторной функции, используя качественный и количественный анализы. Сначала установите аппарат в виде лестницы, затем настройте видеокамеру для записи движений конечностей мыши на аппарате. Далее поместите мышь на стартовую панель и начните запись с помощью видеокамеры.
Убедитесь, что на видео ноги животного находятся в фокусе. Когда мышь коснется последней панели лестничного аппарата, остановите запись. Затем верните мышь к начальной панели и снова запишите прохождение животного через аппарат.
Повторите эту процедуру в общей сложности четыре раза для каждой мыши в каждый день проведения испытаний. Впоследствии, при анализе видео, вручную подсчитайте количество проскальзываний каждой конечности, воспроизводя видео со скоростью 1/10. Проскальзывание фиксируется в случае, если конечность соскальзывает между прутьями.
Когда мышам исполнится шесть недель, оцените их силу хвата. Используйте датчик деформации (тензодатчик) с функцией растяжения-сжатия, оснащенный треугольной проволокой диаметром 2 мм, закрепленной на панели. Поместите мышь на панель, удерживая ее за хвост.
Затем позвольте мыши дотронуться передними конечностями до металлической проволоки. Как только мышь зацепится за проволоку, осторожно потяните её за хвост, пока она не разожмет захват. Прибор зарегистрирует пиковое усилие воздействия на проволоку в граммах.
Повторите этот тест пять раз, прежде чем дать мыши отдохнуть. В ходе теста на силу хвата наблюдаются заметные движения, характеризующие точность выполнения. Постарайтесь зафиксировать такие движения в течение пяти попыток, после чего обеспечьте мыши отдых в течение как минимум одной минуты для снижения мышечного утомления.
После того как мышь отдохнет не менее одной минуты, повторите серию из пяти испытаний. Затем снова дайте мыши отдохнуть и выполните серию в последний раз для этого дня тестирования. Для анализа используйте среднее значение трех наибольших результатов либо для одной передней конечности, либо для обеих передних конечностей.
После извлечения головного мозга животных в возрасте 14 недель с гипоксически-ишемическим повреждением была проведена морфологическая оценка, по результатам которой повреждения коры были классифицированы как отсутствующие, легкие или тяжелые. Те же животные прошли МРТ-сканирование за неделю до этого, которое также дало весьма информативные результаты. Даже в морфологически нормальном мозге наблюдалось легкое повреждение гиппокампа.
В возрасте шести недель, через пять недель после травмы, мыши были протестированы с помощью различных поведенческих тестов. У мышей с гипоксически-ишемическим повреждением наблюдалось когнитивное нарушение в тесте на пассивное избегание в течение 24 часов. Поскольку повреждение затрагивало только правое полушарие, у мышей наблюдались гемиплегические двигательные функции.
Это было выявлено по разнице в проценте проскальзываний на поперечных перекладинах лестницы для каждой передней конечности. Кроме того, поскольку сила хвата задействует моторную кору головного мозга, в группах с нормой и с повреждением коры наблюдались различия в силе хвата. Между контрольной группой с нормой и категорически неповрежденными мышами различий не наблюдалось, однако у поврежденных мышей функции были явно нарушены.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как перевязать правую общую сонную артерию для создания модели неонатальной гипоксически-ишемической энцефалопатии у мышей, а также о том, как проводить последующий поведенческий анализ. Важно отметить, что даже при отсутствии видимых повреждений коры головного мозга через семь дней после травмы МРТ может выявить повреждение гиппокампа. Кроме того, важно помнить о необходимости бережного обращения с детенышами и максимально быстром проведении операции.
Кожа щенков очень тонкая и нежная, поэтому будьте предельно осторожны.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются эффекты неонатального гипоксически-ишемического (ГИ) повреждения головного мозга на модели мышей. Для создания модели ГИ у щенков мышей линии CD-1 на 7–10-й postnatal day проводили одностороннюю окклюзию сонной артерии, что позволило оценить нейроповеденческие функции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Перинатальное повреждение головного мозга
- Оценка моторных и когнитивных функций
Теоретические сведения
- Неонатальное гипоксически-ишемическое повреждение головного мозга представляет собой серьезную проблему в области детского здравоохранения.
- Данная модель помогает понять влияние таких повреждений на развитие мозга.
- Она служит доклинической моделью для таких состояний, как детский церебральный паралич и неонатальные инсульты.
- Правильная идентификация сонной артерии может быть затруднительна для тех, кто только осваивает данную методику.
Цель исследования
- Создать надежную модель гипоксически-ишемического (ГИ) повреждения головного мозга у новорожденных мышей для проведения исследований.
- Оценить влияние ГИ на двигательные и когнитивные функции у мышей.
- Получить данные о потенциальных терапевтических подходах к лечению повреждений головного мозга у новорожденных.
Используемые методы
- Хирургическая операция по одностороннему перевязыванию сонной артерии у мышат.
- Оценка нейроповеденческих функций после операции.
- Сравнение оперированных мышей с неоперированной контрольной группой.
- Сотрудничество со студентами магистратуры для демонстрации процедуры.
Основные результаты
- Создание модели неонатальной гипоксически-ишемической энцефалопатии (ГИЭ) у мышей линии CD-1.
- Выявление значимых различий в нейроповеденческих функциях.
- Изучение влияния ГИЭ на моторное и когнитивное развитие.
- Валидация модели для дальнейших исследований повреждений головного мозга в неонатальном периоде.
Выводы
- Односторонняя окклюзия сонной артерии является эффективным методом моделирования гипоксически-ишемического поражения (ГИП) у новорожденных.
- Данная модель может способствовать дальнейшему исследованию терапевтических стратегий.
- Понимание нейроповеденческих исходов имеет решающее значение для лечения повреждений головного мозга у новорожденных.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данная модель гипоксически-ишемического поражения головного мозга у новорожденных мышей представляет собой доклиническую систему для оценки моторного и когнитивного дефицита, характерного для детского церебрального паралича и неонатального инсульта. Поведенческие тесты позволяют снизить риски при разработке терапевтических кандидатов, устанавливая связь между повреждением правого полушария и функциональными исходами. Модель способствует валидации мишеней и разработке методов анализа в исследованиях нейродегенеративных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся гемиплегической двигательной дисфункции и когнитивных нарушений.
- Операционная ценность: предоставляет релевантную модели заболевания систему для функциональной валидации мишеней в путях повреждения мозга новорожденных.
- Прогностическая ценность: повышает прогностическую достоверность путем корреляции степени тяжести повреждения коры с результатами двигательных и когнитивных тестов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: формирование стандартизированных нейроповеденческих показателей (латентный период пассивного избегания, количество промахов на лестнице, сила хвата) для скрининга соединений.
- Количественное измерение: получение воспроизводимых, количественно определяемых конечных точек, подходящих для высокопроизводительного поведенческого анализа.
- Релевантность скрининга: подготовка валидированных биологических систем для последующей оценки нейропротекторных или нейрорегенеративных агентов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует условия гипоксически-ишемического поражения (ГИП) у новорожденных человека, такие как детский церебральный паралич и неонатальный инсульт, с подтвержденной валидностью по моторному дефициту.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от этапа открытия к доклинической валидации с помощью когнитивного и моторного фенотипирования, соответствующего клиническим наблюдениям.
- Принятие решений с учетом рисков: Обосновывает критерии принятия решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем количественной оценки тяжести повреждения с помощью поведенческих фенотипов, коррелирующих с данными МРТ.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данная модель вписывается в континуум исследований — от валидации мишени до доклинических испытаний эффективности, что позволяет проводить лонгитюдную оценку нейроповеденческого восстановления.
- Биологические исследования: способствует уточнению путей передачи сигнала и снижению биологических рисков при изучении мишеней, участвующих в гипоксически-ишемических каскадах.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу фенотипов со стандартизированными показателями двигательных и когнитивных функций для оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных (латентный период, частота промахов, сила хвата) для межгруппового сравнения и расчета величины эффекта.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преклиническую преемственность за счет стратификации повреждений, подтвержденной МРТ, и лонгитюдного поведенческого мониторинга.
- Корпоративное использование: служит многократно используемой платформой для скрининга различных терапевтических методов в рамках программ по изучению нейродегенеративных повреждений и нарушений развития.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: снижает механистическую неопределенность, связывая одностороннее лигирование сонной артерии со специфическим функциональным дефицитом полушария.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных хирургических и поведенческих протоколов в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения ранних прогностических сигналов об эффективности восстановления двигательных и когнитивных функций.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе восстановления поведенческих функций в когортах с сопоставимыми повреждениями.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических операций на новорожденных грызунах и микрохирургического лигирования сосудов.
- Результат зависит от наличия гипоксической камеры и точного регулирования подачи газов для стабильного индуцирования повреждения.
- Необходимо проведение слепого поведенческого тестирования для исключения предвзятости наблюдателя при подсчете промахов и измерении латентного периода.
- Требуется адаптация поведенческого аппарата под размер и двигательные способности мышей в возрасте шести недель.
- Метод ограничен вариабельностью пенетрантности повреждения, что требует проведения послеоперационной МРТ или морфологического скрининга для стратификации когорт.
