Роман клинических класс изоляции метод человеческая почка периваскулярной стромальные клетки

Общая цель данного метода выделения клинического уровня заключается в получении периваскулярных стромальных клеток почек человека, или kPSC, для клеточной терапии различных заболеваний почек. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины, например, о пригодности kPSC человека для терапии центральных нервов при заболеваниях почек и трансплантации. Основными преимуществами данной методики являются ее соответствие клиническим стандартам и возможность получения достаточного количества kPSC для целей клеточной терапии.

Эллен Ливерс, техник нашей лаборатории, продемонстрирует функциональное тестирование kPSC. Перед началом процедуры изоляции клеток почки подключите стерильный перфузионный лоток к водяной бане в вертикальном положении. Когда перфузионный лоток прогреется в воде, переведите его в горизонтальное положение, не отсоединяя от водяной бани, затем вставьте трубку L/S 25 в насос.

Поместите культуральный пинцет на один конец трубки и положите трубку на дно кюветы. Положите на трубку стерильную марлю, чтобы предотвратить закупоривание, и прикрепите люэровский коннектор к другому концу трубки, затем добавьте в кювету примерно 100 milliliters среды и начните промывание трубки L/S 25 при скорости насоса 100 milliliters в минуту. Чтобы выделить клетки почек, перенесите почку из двойных стерильных пакетов на стерильный перфузионный лоток, и с помощью ножниц и осторожного разрыва удалите периренальную жировую ткань и капсулу почки.

После обнаружения почечной артерии на лоскуте аорты используйте вспомогательный штифт для канюлирования почечной артерии и закрепите штифт стерильной стяжкой. При включенном насосе подсоедините конец трубки насоса к люэровскому соединителю. Промойте почку средой из кюветы при скорости потока 100 milliliter per minute.

Затем добавьте в лоток для перфузии 20 миллилитров коллагеназы и 2,5 миллилитра ДНКазы и дайте ферментам переварить почку, время от времени осторожно поворачивая орган вручную, пока он не станет мягким, а перфузионная жидкость не начнет становиться мутной. Продолжительность переваривания коллагеназой имеет решающее значение: слишком короткое время приведет к образованию клеточных комков, а слишком длительное — к гибели клеток. По завершении ферментативной перфузии осторожно массируйте почку до получения суспензии клеток, после чего удалите непереваренный материал и иглу.

Добавьте 50 мл нормальной сыворотки человека в суспензию клеток, затем, установив низкую скорость потока насоса, поместите трубку, подключенную к почке, над несколькими пробирками объемом 50 мл, чтобы суспензия клеток стекала из лотка для перфузии в пробирки для сбора. После сбора всех клеток центрифугируйте суспензии и дважды промойте осадки промывочной средой, дополненной 10% нормальной сыворотки человека. После второго промывания ресуспендируйте осадки в объеме питательной среды для культур клеток, равном объему клеточных осадков.

Для культивирования неочищенных клеток почек добавьте примерно 1 мл клеточной суспензии в 24 мл среды для культивирования клеток alpha-MEM с 5% лизата тромбоцитов на один флакон для культивирования клеток T 175 и инкубируйте флаконы при 37 °C и 5% CO2. Через два дня удалите супернатант и клеточный дебрис, затем замените среду на 25 мл свежей среды для культивирования клеток. После достижения клетками конфлюэнтности выделите фракцию NG2-положительных клеток методом магнитной сепарации клеток в соответствии со стандартными протоколами.

Затем высейте NG2-положительные клетки с плотностью 4 × 10³ клеток на см² в культуральный флакон подходящего размера и поместите флакон в инкубатор для культивирования клеток. Когда клетки достигнут 90–100% конфлюэнтности, соберите супернатант и дважды промойте адгезивные клетки в PBS. Отделите клетки, добавив соответствующий объему флакона объем трипсина, и через пять минут остановите реакцию, добавив сохраненный супернатант.

Осторожно ресуспендируйте клетки, затем перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку соответствующего размера для центрифугирования и повторно высейте клетки с плотностью 4 × 10³ клеток на см².

После четырех-пяти пассажей высейте kPSC в шестилуночный планшет в концентрации 2 × 10⁵ клеток на 2 мл среды на лунку, а 5 × 10⁵ клеток проксимальных эпителиальных клеток канальцев высейте в 2 мл среды для проксимальных эпителиальных клеток канальцев на лунку в отдельный шестилуночный планшет. Поместите оба планшета в инкубатор для клеточных культур на 48 часов; по окончании инкубации соберите супернатант клеток kPSC, затем удалите супернатант проксимальных эпителиальных клеток канальцев и с помощью желтого наконечника дозатора сделайте царапину в монослое клеток на дне каждой лунки. Промойте поврежденные клетки раствором PBS и добавьте кондиционированную среду из культур почечных васкулярных стромальных клеток.

Затем с помощью инвертированного микроскопа в режиме светлого поля сделайте снимки области царапины через четыре, восемь, 12 и 24 часа в одной и той же отмеченной позиции, чтобы оценить процент закрытия раны с течением времени. Периваскулярные стромальные клетки почки представляют собой пластик-адгезивные веретеноподобные клетки, которые экспрессируют маркеры стромальных и периваскулярных клеток и не экспрессируют маркеры CD31, CD34, CD45 и HLA-DR. Как правило, гомогенная популяция периваскулярных стромальных клеток почки достигается к четвертому пассажу, при этом клетки достигают стадии старения примерно к девятому или десятому пассажу.

В данном репрезентативном анализе заживления царапины (wound scratch assay), проведенном для оценки функциональной способности kPSC, при добавлении кондиционированной среды из культуры периваскулярных стромальных клеток почки рана закрывалась значительно быстрее, чем в лунках с контрольной средой. После освоения техники первичного выделения, которая занимает около двух часов, вам потребуется от одного до двух месяцев для получения гомогенной популяции kPSC. При выполнении данной процедуры важно прекратить обработку коллагеназой, как только ткань почки станет мягкой, а жидкости — менее прозрачными.

Помимо продемонстрированных здесь процедур, данные методы могут быть использованы и для выделения периваскулярных стромальных клеток из других солидных органов. kPSCs, выделенные с помощью этой методики, могут быть использованы для изучения регенеративного потенциала этих клеток в различных моделях заболеваний почек и трансплантации. После просмотра данного видео вы сможете выделять и культивировать kPSCs в соответствии с клиническими стандартами.

Не забывайте, что работа с материалом человеческого происхождения сопряжена с риском передачи вирусов; при выполнении данной процедуры всегда принимайте меры предосторожности, такие как тестирование на ВИЧ, гепатит B и гепатит C.