Индукция клеточной дифференцировки и визуализации отдельных клеток Vibrio parahaemolyticus Плоттеры и богомольцы

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы индуцировать клеточную дифференцировку бактерии Vibrio parahaemolyticus и формирование популяции дифференцированных роевых клеток, легко доступных для анализа отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод поможет ученым понять, как бактерии регулируют внутриклеточную организацию во время клеточной дифференцировки и морфогенеза. Поскольку визуализация клеток в бактериальных сообществах может быть сложной задачей, основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет получить популяцию дифференцированных роевых клеток, которые существуют в одном клеточном слое, легко доступном для микроскопического анализа отдельных клеток.

Применение этого метода простирается на лучшее понимание того, как бактерии регулируют изменения в клеточном цикле, морфологии клеток и внутриклеточной организации во время клеточной дифференцировки. Демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку надежная индукция клеточной дифференцировки и формирование клеток, доступных для анализа отдельных клеток, трудно достижимы. Для приготовления агарового раствора для изготовления роящихся тарелок суспензируют четыре грамма сердечного настоя, или порошка H.I.agar, и 100 миллилитров дважды дистиллированной воды.

Тщательно вскипятите раствор H.I.agar в микроволновой печи, время от времени встряхивая бутылку до полного растворения порошка. Автоклавируйте агаровый раствор при температуре 121 градус Цельсия в течение 20 минут, охладите агаровый раствор до 60 т0 65 градусов Цельсия при постоянном помешивании. Следующий шаг включает в себя обращение с 2,2'-бипиридилом, который является высокотоксичным, поэтому необходимо надевать перчатки и защитные очки.

Добавьте 2,2'Бипиридил до конечной концентрации 50 микромоляров. Добавьте хлорид кальция до конечной концентрации четыре милламолара. Инокулируйте небольшое количество клеток V.parahaemolyticus с края одной колонии в 5 миллилитров бульона LB.

Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в шейкерном инкубаторе до тех пор, пока она не достигнет оптической плотности в 600 нанометров 0,8. Обычно это занимает около двух-трех часов. Пока клеточная культура растет, пипеткой нанесите от 30 до 35 миллилитров конечного раствора H.I.agar в круглую чашку Петри диаметром 150 мм и дайте агару застыть.

Непосредственно перед обнаружением клеточной культуры высушите агаровую пластину в вертикальном положении с открытой крышкой при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 10 минут или до тех пор, пока не исчезнут остатки жидкости, но не более. Нанесите один микролитр клеточной культуры в центр роящейся пластины H.I.agar и дайте пятну высохнуть. Заклейте пластину прозрачной пластиковой лентой, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха и складок на ленте.

Инкубируйте тарелку при температуре 24 градуса Цельсия на ночь. Это приведет к образованию роевой колонии V.Parahaemolyticus с роевыми вспышками, распространяющимися из центра колонии, как показано в этом видеоролике. Первым этапом этой процедуры является подготовка агарозных стекол для микроскопии.

Добавьте один грамм агарозы в 100 миллилитров 20% PBS и 10% раствор бульона. Осторожно вскипятите раствор в микроволновой печи, чтобы агароза растворилась, а затем дайте ему остыть до 65-70 градусов Цельсия, перемешивая с помощью магнитной мешалки. Поместите чистое предметное стекло микроскопа на идеально ровную часть рабочего стола.

Закрепите предметное стекло на столе, накрыв оба конца предметного стекла двумя слоями лабораторной маркировочной ленты общего назначения. Расстояние между двумя кусками ленты должно быть около трех сантиметров. Нанесите пипеткой около 250 микролитров приготовленного ранее раствора агарозы на непокрытую стеклянную поверхность.

Поместите второе предметное стекло микроскопа в той же ориентации, что и нижнее предметное стекло сверху, и слегка надавите, чтобы остатки агарозы могли вытекать в стороны. Дайте агарозе застыть в течение одной-двух минут. С помощью скальпеля отрежьте остатки агарозы, прикрепленные к боковым сторонам предметного стекла микроскопа.

Когда агароза застынет, медленно горизонтально потяните верхнюю стеклянную горку от нижней. Медленно снимите скотч с торцов предметного стекла микроскопа. Агарозную горку следует использовать как можно скорее, так как она начнет медленно подсыхать.

Непосредственно перед переносом клеток сворера на предметное стекло микроскопа с помощью скальпеля срезайте пластиковую ленту с заранее подготовленной пластины сворера. Во время иссечения роящегося агара важно направлять разрез снаружи внутрь роящейся колонии, чтобы избежать загрязнения роящихся факелов клетками, происходящими из середины колонии. Используйте свежий скальпель, чтобы вырезать кусок роящегося агара размером три на 10 миллиметров с самого внешнего края роящейся колонии, стараясь направлять надрезы с внешней стороны края роящейся колонии внутрь колонии.

Перенесите кусочек роящегося агара на предметное стекло микроскопа с помощью агарозного стекла клетками, обращенными к агарозной прокладке, чтобы запечатлеть роящиеся клетки на агарозной прокладке. Подождав около 30 секунд, осторожно извлеките кусочек агара из агарозной подушечки. Положите стеклянный покровный лист на агарозную подушечку, где были отпечатаны клетки.

Теперь клетки готовы к флуоресцентной микроскопии. Стереомикроскопическая визуализация колонии V.parahaemolyticus при возрастающем увеличении показывает вспышки роя, распространяющиеся с периферии роевой колонии. Ячейки в вспышках сгруппированы только в моно- или бислой, в то время как ячейки в середине роевой колонии уложены в несколько слоев.

Микроскопия DIC показала, что вспышки состоят только из полностью дифференцированной популяции роевых клеток, в то время как клетки из середины роевой колонии значительно короче и, вероятно, представляют собой смесь клеток пловца и роя. В качестве доказательства принципа была проведена ДВС-и флуоресцентная микроскопия на клетках пловца дикого типа V.Parahaemolyticus и swarmer, эктопически экспрессирующих незаменимый белок хемотаксиса, YFP-CheW. В клетках пловцов YFP-CheW локализуется униполярным и биполярным образом, но в клетках бродяжничества YFP-CheW всегда локализован биполярно, а также образует кластеры, расположенные случайным образом по длине клетки.

Изменения в характере локализации YFP-CheW во время дифференцировки клеток пловца в роевые клетки также были показаны с помощью отображения распределения очагов и демографического анализа профилей интенсивности флуоресценции. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии микробных клеток, чтобы изучить, как бактерия Vibrio parahaemolyticus регулирует свою внутреннюю организацию во время различных дифференцированных состояний клеток пловца и роя. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как индуцировать клеточную дифференцировку бактерий Vibrio parahaemolyticus и как подготовить популяцию дифференцированных клеток Swarmer для анализа отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.

Не забывайте, что парагемолитический вибрион является патогеном человека, и необходимо применять надлежащие процедуры и правила по обращению с патогенами BSL 2 в вашем регионе.