Трехмерные ткани спроектированы в соответствие экзоцитоз сетей для пилки развития механизмов и содействия регенерации нервной системы

Этот протокол направлен на руководство изготовлением самоорганизующихся трехмерных пучков продольно выровненных астроцитарных сомат и процессов внутри гидрогелевой микроколонки микронного размера для использования в качестве нейробиологической модели in vitro или в качестве нейрорегенеративной терапии. Травмы и нейродегенеративные заболевания особенно вредны для пациентов из-за ограниченной нейрогенной способности в тормозной среде, которая ограничивает регенерацию в центральной нервной системе. Сконструированные астроцитарные пучки устраняют ограничения современных стратегий лечения, пытаясь воспроизвести ключевые нейроанатомические особенности и глиа-опосредованные механизмы развития для стимулирования целевой миграции клеток и поиска путей аксонов.

Архитектура этих астроцитарных каркасов в первую очередь вдохновлена выровненными астроцитарными процессами в глиальных трубах рострального миграционного потока. Начните с приготовления 3%-ного веса на объем агарозного раствора и DPBS в стерильной стакане. Поддерживайте нагрев и помешивание, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание раствора.

Вставьте акупунктурную иглу в нижнее отверстие дозатора для луковиц. Поместите капиллярную трубку на открытую иглу и закрепите их, введя часть ее в резиновую секцию цилиндра дозатора для ламп. Закройте цилиндр крышкой, чтобы завершить сборку.

Перелейте один миллилитр жидкой агарозы на поверхность пустой чашки Петри. Зажав резиновый колпачок дозатора для ламп, вставьте один конец капиллярной трубки в агарозу и ослабьте давление на колпачок, чтобы втянуть агарозу в трубку. Поместите колбу, трубку, игольчатые узлы на чашку Петри и дайте агарозе застыть внутри капиллярных трубок в течение 5 минут.

Затем вытяните иглу из капиллярной трубки, оставив микростолбик вокруг иглы. С помощью кончиков форцепса подтолкните микроколонку к концу иглы, затем держите иглу над открытой чашкой Петри, содержащей DPBS, и протолкните микроколонку в DPBS. Чтобы изготовить лодочки с микроколоннами, которые облегчают последующее обращение с этими конструкциями, начните с изготовления 4% веса на объем раствора агарозы и поддержания раствора в подогреве и перемешивании.

С помощью щипцов переместите микроколонку в пустую чашку Петри. Затем, работая под стереоскопом, с помощью микроскальпеля обрезайте микроколонки до нужной длины, причем концы подрезаются под углом 45 градусов. Обрезав еще три микростолбца, выровняйте четыре столбца параллельно.

Загрузите в пипетку 50 микролитров 4%-ного раствора агарозы и распределите линию жидкости по массиву микроколонок, чтобы соединить и связать конструкции в лодочку. Дайте остыть в течение 1-2 минут, чтобы обеспечить гелеобразование 4%-ной агарозы. Затем с помощью тонких щипцов подхватите лодку с микроколоннами по соединяющему агарозному мосту.

И переместите его в чашку Петри, содержащую DPBS. Переложите микроколонную лодку в шкаф биобезопасности и простерилизуйте с воздействием ультрафиолета в течение тридцати минут. В шкафу биобезопасности приготовьте 1 миллиграмм на миллилитр раствор коллагена типа 1 типа крысиного хвоста в среде для совместного культивирования.

А затем положите его на лед. При необходимости отрегулируйте pH раствора ECM с помощью кислоты или основания до тех пор, пока pH не станет стабильным в диапазоне от 7,2 до 7,4. Перенесите лодочку для микроколонн в чашку Петри объемом 35 или 60 мл с помощью щипцов.

Используя стереоскоп для наведения, расположите наконечник микропипетки объемом 10 мл на одном конце каждой микроколонки и отсосите, чтобы освободить просвет от DPBS и пузырьков воздуха. Зарядите микропипетку P10 раствором коллагена. Поместите наконечник объемом 10 мл на один конец каждой микроколонки и введите достаточное количество раствора для заполнения просвета.

Затем наведите пипеткой резервуар ECM на обоих концах микроколонки. После того, как все колонки будут заполнены, нанесите пипетку на сокультурную среду в кольцо вокруг чашки Петри, чтобы предотвратить высыхание колонок. Инкубируйте чашку, содержащую микроколонки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, в течение не менее одного часа, чтобы стимулировать полимеризацию коллагена перед добавлением клеток.

После этого поместите наконечник микропипетки P10 на один конец микроколонки и перенесите примерно 5 мл клеточного раствора в просвет для его заполнения. После установки всех микроколонн в лодку инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 1 часа, чтобы способствовать прикреплению астроцитов к ECM. После периода инкубации тщательно заполните чашки, содержащие сидячие микроколонны, 3 или 6 мл кокультуральной среды, для 35 или 60 мл чашек Петри соответственно.

Поддерживайте температуру покрытых микроколонок и культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы способствовать самосборке выровненных астроцитарных пучков, которые должны сформировать связную, кабелевидную структуру через шесть-десять часов. Через час после нанесения покрытия астроциты имеют сферическую форму и рассеиваются по всей конструкции. Через пять часов после нанесения покрытия астроциты инициируют удлинение и сокращение процесса.

Через восемь часов после осаждения астроциты выравниваются и сокращаются. К 24 часам после нанесения покрытия в этом примере образуется плотный пучок астроцитарных отростков. Этот полностью сформированный астроцитарный пучок через 24 часа после нанесения покрытия демонстрирует эффект застежки-молнии, когда концы кабеля прикрепляются к различным концам стенки просвета.

В этом видео показана обвязка в действии через 3–10 часов после нанесения покрытия. Иммуномаркировка астроцитарных скаффолдов демонстрирует продольное выравнивание астроцитарных процессов. На этом конфокальном изображении астроцитарного пучка считывается астроцитарный маркер GFAP.

А ядра видны синим цветом. Такое большее увеличение пучка позволяет визуализировать цитоархитектуру астроцитов в микроколонках. После просмотра этого видео вы сможете изготовить живые каркасы, состоящие из продольно выровненных астроцитарных пучков с биологически вдохновленной цитоархитектурой внутри оболочки из биоматериала.

После этой процедуры может быть разработана стратегия трансплантации, направленная на доставку астроцитарных пучков с оболочкой из биоматериала или без нее в поврежденную ткань мозга, чтобы способствовать направленной миграции клеток из нейрогенных областей и воздействовать на ограничивающее микроокружение ЦНС. Кроме того, этот метод может быть расширен в качестве биофиделической моделирующей платформы, опосредованной глиа-опосредованным нейробиологическим феноменом, извлекающим выгоду из мимикрии нативной трехмерной среды и присущего экспериментальному контролю систем in vitro.