Трехмерные ткани спроектированы в соответствие экзоцитоз сетей для пилки развития механизмов и содействия регенерации нервной системы

Данный протокол предназначен для изготовления самосборных трехмерных пучков продольно ориентированных тел и отростков астроцитов внутри гидрогелевой микроколонки микронного размера для использования в качестве нейробиологической модели in vitro или в качестве нейрорегенеративной терапии. Травмы и нейродегенеративные заболевания особенно пагубно сказываются на пациентах из-за ограниченного нейрогенного потенциала в ингибирующей среде, которая ограничивает регенерацию в центральной нервной системе. Инженерные пучки астроцитов позволяют преодолеть ограничения современных стратегий лечения, имитируя ключевые нейроанатомические особенности и опосредованные глией механизмы развития для стимуляции направленной миграции клеток и поиска пути аксонами.

Архитектура этих астроцитарных каркасов в первую очередь вдохновлена выровненными астроцитарными отростками в глиальных трубках рострального миграционного потока. Начните с приготовления 3% по массе/объему раствора агарозы и DPBS в стерильном стакане. Продолжайте нагрев и перемешивание, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание раствора.

Вставьте иглу для акупунктуры в нижнее отверстие баллонного диспенсера. Наденьте капиллярную трубку на выступающую часть иглы и зафиксируйте их, вставив часть трубки в резиновую секцию цилиндра баллонного диспенсера. Закройте цилиндр колпачком, чтобы завершить сборку.

Перенесите 1 мл жидкого агарозы на поверхность пустой чашки Петри. Зажав резиновый колпачок дозатора-груши, погрузите один конец капиллярной трубки в агарозу, затем отпустите колпачок, чтобы втянуть агарозу в трубку. Поместите сборки из груши, трубки и иглы на чашку Петри и оставьте агарозу в капиллярных трубках для затвердевания на 5 минут.

Затем извлеките иглу из капиллярной трубки, оставив микроколонку вокруг иглы. С помощью кончиков пинцета сдвиньте микроколонку к концу иглы, затем удерживая иглу над открытой чашкой Петри с DPBS, вытолкните микроколонку в DPBS. Чтобы изготовить «лодочки» для микроколонок, которые облегчают последующее манипулирование этими конструктами, начните с приготовления 4% (вес/объем) раствора агарозы, поддерживая раствор в нагретом и перемешиваемом состоянии.

С помощью пинцета перенесите микроколонку в пустую чашку Петри. Затем, работая под стереомикроскопом, с помощью микроскальпеля обрежьте микроколонки до нужной длины, срезая концы под углом 45 градусов. Обрезав еще три микроколонки, расположите четыре колонки параллельно друг другу.

Наберите в пипетку 50 µl 4% раствора агарозы и нанесите полоску жидкости поверх массива микроколонок, чтобы соединить конструкции и объединить их в единую структуру («лодку»). Оставьте для охлаждения на 1–2 минуты до полного застывания 4% агарозы. Затем с помощью тонкого пинцета поднимите «лодку» из микроколонок, захватив соединяющий агарозный мостик.

Затем переместите его в чашку Петри с DPBS. Перенесите лоток с микроколонками в бокс биологической безопасности и стерилизуйте воздействием ультрафиолетового излучения в течение тридцати минут. В боксе биологической безопасности приготовьте раствор коллагена 1-го типа из хвоста крысы в концентрации 1 mg/mL в среде для совместного культивирования.

Затем поместите образец на лед. При необходимости отрегулируйте pH раствора ECM с помощью кислоты или щелочи до достижения стабильного значения в диапазоне от 7.2 до 7.4. С помощью пинцета перенесите лодочку с микроколонкой в чашку Петри объемом 35 или 60 mL.

Ориентируясь по стереомикроскопу, поместите наконечник микропипетки объемом 10 мкл к одному из концов каждой микроколонки и произведите аспирацию, чтобы удалить из просвета DPBS и пузырьки воздуха. Наберите в микропипетку P10 раствор коллагена. Приложите наконечник объемом 10 мкл к одному из концов каждой микроколонки и внесите достаточное количество раствора, чтобы заполнить просвет.

Затем нанесите пипеткой резервуар из ВМ в обоих концах микроколонки. После заполнения всех колонок нанесите пипеткой среду для кокультивирования кольцом по периметру чашки Петри, чтобы предотвратить высыхание колонок. Инкубируйте чашку с микроколонками при 37 °C и 5% CO₂ в течение как минимум одного часа для инициации полимеризации коллагена перед добавлением клеток.

После этого поместите кончик микропипетки P10 к одному из концов микроколонки и перенесите примерно 5 mL клеточного раствора в просвет, чтобы заполнить его. Разместив все микроколонки в лотке, инкубируйте их при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение 1 часа для стимуляции прикрепления астроцитов к ECM. По истечении периода инкубации осторожно заполните чашки с установленными микроколонками 3 или 6 mL среды для кокультивирования для чашек Петри объемом 35 или 60 mL соответственно.

Поддерживайте микроколонки с посевом и культуру при 37 °C и 5% углекислого газа для стимуляции самосборки выровненных астроцитарных пучков, которые должны сформировать пучковую, кабелеподобную структуру через шесть-десять часов. Через один час после посева астроциты имеют сферическую форму и распределены по всему конструкту. К пятому часу после посева астроциты начинают вытягивать отростки и сокращаться.

Через восемь часов после посева астроциты выровнялись и сократились. К 24 часам после посева в данном примере сформировался плотный пучок астроцитарных отростков. Этот полностью сформированный астроцитарный пучок спустя 24 часа после посева демонстрирует эффект «застежки-молнии», при котором концы кабеля прикрепляются к разным концам стенки просвета.

На данном видео показан процесс формирования пучков спустя 3–10 часов после посева. Иммуноокрашивание астроцитарных каркасов демонстрирует продольное выравнивание астроцитарных отростков. На этом конфокальном изображении астроцитарного пучка виден астроцитарный маркер GFAP.

Ядра видны синим цветом. Такое большее увеличение пучка позволяет визуализировать цитоархитектонику астроцитов внутри микроколонок. После просмотра этого видео вы сможете создавать живые каркасы, состоящие из продольно ориентированных пучков астроцитов с биологически обоснованной цитоархитектоникой внутри оболочки из биоматериала.

После выполнения данной процедуры можно разработать стратегию трансплантации для доставки астроцитарных пучков (с биоматериальной оболочкой или без нее) в поврежденные ткани мозга, чтобы стимулировать направленную миграцию клеток из нейрогенных зон и обеспечить их ориентирование в ограничивающей микросреде ЦНС. Кроме того, данный метод может быть расширен до биофидельной моделирующей платформы для изучения опосредованных глией нейробиологических явлений, что дает преимущество за счет имитации естественной трехмерной среды и присущего системам in vitro экспериментального контроля.