Тюнинг в театре Hippocampal Theta Band In Vitro: Методологии для записи из изолированной цепи грызунов Septohippocampal

Здесь мы представляем протокол для записи ритмических нейронных сетевых тета и гамма-колебаний из изолированного цельного гиппокампального препарата. Мы описываем экспериментальные этапы извлечения гиппокампа на детали записей о полевых, унитарных и цельных клеточных зажимах, а также оптогенетическую стимуляцию тета-ритма.

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы представить процедуры извлечения всего гиппокампа и исследовать создание ритмической нейронной сети с использованием полевых, унитарных и патч-клэмпинговых записей, а также оптогенетической стимуляции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии в области обучения и памяти, значительно облегчая изучение клеточных и синаптических механизмов, лежащих в основе ритмических колебаний в гиппокампе. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она использует оптимизированную подготовку для исследования цепей в детальных колебаниях, которые играют решающую роль в информации, зависящей от гиппокампа.

Чтобы начать эту процедуру, поместите мозг на диссекционную чашку в вертикальном положении, удалите мозжечок лезвием бритвы, затем разрежьте мозг пополам по средней сагиттальной плоскости и верните два изолированных полушария в камеру удержания. Затем поместите один полусекированный мозг вертикально на чашку для вскрытия. Поворачивайте чашку до тех пор, пока средние сагиттальные структуры не окажутся обращенными к экспериментатору, и встроенный контур септального комплекса будет виден в виде тонкого грушевидного слоя ткани внутри таламуса.

Затем вставьте шпатель с покрытием под перегородку и двигайте кончик вниз, пока не дойдете до чашки для вскрытия, разрежьте волокна, которые сердечно соединяют область перегородки. Теперь повторите ту же операцию по переднему краю перегородки и разрежьте волокна, которые соединяются с лобной частью мозга. С помощью шпателя, слегка удерживая внутреннюю часть коры чуть выше гиппокампа в вертикальном положении, с помощью микрошпателя осторожно потяните вниз таламическое, гипоталамическое и оставшиеся ядра ствола мозга.

Впоследствии с помощью шпателя отрежьте и удалите отторгнутую ткань. После этого вставьте покрытый шпатель в боковой желудочек ниже рострального конца дорсального гиппокампа. Держите шпатель горизонтально, выровненный по среднесагиттальной плоскости полуизолированного мозга, и проведите им по гладкому контуру стенок желудочков, пока кончик не выйдет на поверхность

Держите шпатель под гиппокампом и слегка надавите им на соединительные волокна вдоль внутреннего слоя, где гиппокамп соединяется с вышележащей корой, затем нанесите микрошпатель на внешнюю сторону этого слоя и прижмите его к покрытому шпателю, чтобы разрезать соединительные волокна. Чтобы завершить извлечение, поверните дискретальную чашку и вставьте покрытый шпатель под вентральный гиппокамп. Слегка возьмитесь за гиппокамп шпателем и разрежьте эндокринные соединения режущими движениями против шпателя.

После завершения изоляции оставьте гиппокамп лежать на тарелке и добавьте каплю ледяного раствора сахарозы, чтобы он оставался прохладным. Осторожно обрежьте оставшуюся кору головного мозга и волокна и отделите гиппокамп от перегородки, аккуратно приложив лезвие бритвы к своду. После этого переложите препарат в раствор сахарозы комнатной температуры и дайте ему восстановиться в течение 15-30 минут, прежде чем переложить в камеру записи.

На этом этапе настройте систему перфузии с гравитационной подачей для обеспечения непрерывной высокой скорости потока насыщенного кислородом ACSF. Затем остановите поток ACSF и перенесите гиппокамп в записывающую камеру, используя широкий конец стеклянной пипетки. Дайте пропитанному сахарозой препарату утонуть и осесть на дно.

Поместите препарат в центр записывающей камеры, с гладкой поверхностью CA1 и субикулума сверху. Стабилизируйте гиппокамп с небольшими весами перегородки и височных конечностей и возобновите поток ACSF. При этой процедуре электрод LFP опускается на поверхность гиппокампа.

Проведите электрод LFP через слой параметров и наблюдайте за увеличением внеклеточной спайковой активности по мере обнаружения разряда одной единицы из отдельных нейронов. Опустите электрод дальше и обратите внимание, что скачки снова начинают исчезать, когда кончик пересекает радиатом. Обратите внимание, что четко видимые колебания сети в тета-диапазоне частот становятся очевидными и достигают максимальной амплитуды по мере того, как место записи опускается через радиоатом.

Чтобы проверить пространственные свойства спонтанных тета-колебаний в области CA1, поместите второй электрод LFP в сайт CA1 и наблюдайте, как тета-колебания CA1 синхронизируются на больших расстояниях. Чтобы проверить свойства тета-колебаний в слоях гиппокампа, оставьте референсный электрод LFP в участке радиатома CA1. Начиная непосредственно над stratum oriens, опустите второй электрод в слой ячеек параметра и через радиатом.

Наблюдайте постепенную инверсию сигнала LFP по всему слою параметров. Чтобы проверить гамма-колебания и тета-гамма-связь в интактном гиппокампе, поместите полевой электрод на границе субикулума CA1 и опускайте его до тех пор, пока он не окажется на границе между параметром и молекулярными слоями. На этом уровне может быть зарегистрирован потенциал поля, показывающий четкие гамма-колебания с изменениями амплитуды, которые синхронизированы с локальным тета-ритмом.

Затем отрегулируйте масштабирование, чтобы наблюдать за медленным временным масштабом тета-гамма-связи. Обратите внимание, что гамма-всплески происходят в двух различных полосах частот, которые могут быть выделены по полосам во время текущего сигнала LFP, в медленном и быстром гамма-диапазоне. Для записи зажима целого клеточного патча во время тета-колебаний гиппокампа in vitro используйте флуоресцентную видеомикроскопию с малой и высокой мощностью, чтобы визуализировать интернейроны tdTomato, расположенные вблизи поверхности препарата гиппокампа с помощью мыши PV Tom.

При малом увеличении гиппокампа поместите электрод LFP в субикулум CA1 для мониторинга тета-колебаний во время подготовки к экспериментам с патч-клэмпом. Затем переключитесь на 40-кратное увеличение и наведите объектив на целевую область. Опустите его до тех пор, пока верхние слои не станут видимыми, под флуоресцентной микроскопией выберите флуоресцентную фотоклетку и подойдите с помощью патч-пипетки, наполненной стандартным межклеточным раствором.

После того, как вы окажетесь в конфигурации всей клетки, изучите физиологические свойства идентифицированной фотоклетки во время спонтанных колебаний гиппокампа. Наблюдайте за регистрацией интецеллюлярных мембранных потенциалов от PV-клеток, которые характеризуются быстрым спайковым поведением и всплесками потенциалов действия, синхронизированными с текущим тета-ритмом CA1 subiculum. В этой процедуре электрод LFP помещается в область субикулума CA1 и подключается ближайшая параметрическая ячейка в изолированном гиппокампе мыши, экспрессирующая чувствительный к синему свету возбуждающий опцин CHR2 в интернейронах PV.

Поместите световод из оптического волокна над препаратом гиппокампа и центрируйте его на записанной области. Используйте синий свет от светодиодного источника для оптической генетической стимуляции, которая состоит из световых импульсов продолжительностью от 10 до 20 миллисекунд или команд напряжения синей волны, подаваемых на тета-частотах. В токовом зажиме характеризуют активность регистрируемой клетки во время спонтанных тета-колебаний.

Затем запустите протокол стимуляции и запишите реакцию света. Обратите внимание, что колебания поля и синаптическая активность, а также регистрируемый нейрон становятся все более синхронизированными во время оптогенетической стимуляции, и что ритмичное движение фотоклеток приводит к надежному контролю как частоты, так и мощности тета-колебаний. Здесь показана электрофизиологическая активность, регистрируемая параметрической ячейкой во время тета-колебаний.

Следы токовых зажимов показывают спонтанное, но не ритмичное возбуждение в состоянии покоя и тормозящие постсинаптические потенциалы, которые не были четко синхронизированы с медленно возникающими колебаниями LFP. Записи на клещах напряжения показывают, что соответствующие тормозящие постсинаптические токи имеют обратный потенциал на уровне около минус 70 милливольт. А вот электрофизиологическая активность, регистрируемая быстрым всплеском флуоресцентного интернейрона PV во время тета-колебаний.

В токовом зажиме эта клетка спонтанно возбуждалась в состоянии покоя и сильно управлялась ритмичными возбуждающими постсинаптическими потенциалами, которые были фазированы, заперты при стабильных колебаниях LFP. При записях с помощью зажимов напряжения возбуждающий постсинаптический потенциал обращения тока был примерно равен нулю милливольт. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-три часа, при этом важно помнить о необходимости энергичного насыщения раствора кислородом и использования перфузионной системы, обеспечивающей высокую скорость, но постоянный поток активированного ACSF по препарату во время электрофизиологической записи.

После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как оптогенетическая стимуляция или подавление популяций определенных типов клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как идентификация клеточных подтипов, которые формируют тета-осцилляторы в гиппокампе. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к систематическому изучению динамики тета-колебаний на септальной височной оси гиппокампа in vitro. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как извлечь препарат целого гиппокампа для того, чтобы исследовать функцию ритмических нейронных сетей с помощью записей полевых, единичных и патчовых зажимов, а также оптогенетической стимуляции.