Химио ферментативного синтеза N- гликанов массив развития и антител ВИЧ профилирования

Общей целью данной методологии является разработка модульного хемоферментативного подхода к синтезу N-гликанов путем создания нового гликанового микрочипа на предметном стекле, покрытом оксидом алюминия, для обнаружения гетерогликанового связывания антител к ВИЧ. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы гликобиологии для идентификации гликанов, специфичных для клеточного вируса, для длительного развития. Основным преимуществом этого метода является обнаружение слабого связывания и идентификация смеси сахаров, которые связываются с белком, таким как антитела, у пациента с ВИЧ.

Последствия этого метода распространяются на диагностику инфекций гриппа, потому что сиалический катаболист экспрессируется на эпителиальных клетках дыхательных путей человека, и проблемы являются общими во время симптомов. Поэтому гликомассив станет идеальным инструментом для определения специфики диких подтипов. Хотя этот метод может обеспечить внутреннюю гликановую специфичность антител к ВИЧ, он также может быть применен к другим системам, таким как диагностика различных видов рака, основанная на характере связывания антител в сыворотке крови человека со специфическими антигенами сыворотки человека, напечатанными на поверхности.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте 2-5 микромолей заранее приготовленного гликана и пятимиллилитровую круглую донную колбу. Добавьте в колбу магнитную мешалку и закройте ее резиновой перегородкой. Добавьте в колбу 400 микролитров свежевысушенного ДМФА и 10-25 микромолей линкера фосфоновой кислоты.

Затем перемешивайте реакционную смесь при 800 об/мин в течение пяти часов. После завершения реакции испарите растворитель с помощью ротационного испарителя при вакуумном давлении от пяти до 10 миллибар и 40 градусах Цельсия. После этого растворите высушенную реакционную смесь и 0,5 миллилитра воды и загрузите сверху слой полиакриламидного геля.

Разбавьте продукты с помощью воды и соберите одну-две миллилитровые фракции. Чтобы проверить собранные фракции с помощью TLC, найдите каждую фракцию на пластине TLC и окуните пластину в 0,25 моляра молибдата церия и аммония. Нагрейте испачканную пластину горячей плитой, чтобы визуализировать продукт.

После соединения продукта, содержащего фракции, и замораживания раствора биофолизируют до получения нужного продукта в виде белого порошка. Далее растворите высушенный продукт в двух миллилитрах воды и добавьте гидроксид палладия. Прикрепите водородосодержащий баллон к колбе и перемешивайте реакционную смесь со скоростью 800 об/мин в течение 15 часов в атмосфере водорода.

Как только реакция завершится, отфильтруйте смесь через слой Celite и промойте двумя миллилитрами метанола и двумя миллилитрами дистиллированной деионизированной воды. Затем испарите растворитель с помощью ротационного испарителя при вакуумном давлении 300 миллибар и 40 градусах Цельсия. После этого растворите смесь корки примерно в одном миллилитре воды и загрузите ее поверх полиакриламидного гелевого слоя.

Разбавьте средство водой и соберите одну-две миллилитровые фракции. После соединения продукта, содержащего фракции, и замораживания раствора биофолизируют до получения нужного продукта в виде белого порошка. Как только продукт высохнет, охарактеризуйте его с помощью энимара и масс-спектроскопии с использованием оксида дейтерия в качестве растворителя.

Для анодирования поверхности установите инкубатор с регулируемой температурой на четыре градуса Цельсия. Затем переложите заранее приготовленный 0,3 моляра водного раствора щавелевой кислоты в стакан объемом 500 миллилитров, содержащий магнитную мешалку. Поместите в раствор платиновый стержень длиной 10 сантиметров в качестве катода.

Продолжайте помешивать щавелевую кислоту со скоростью 300 об/мин в течение всего процесса анодирования. В программном обеспечении для лабораторных трассировщиков нажмите кнопку настройки, а затем выберите функцию Sweep Voltage. Установите начальное и стоповое напряжение на 25,8 вольт.

Количество точек равно 100, соответствие — единице, а задержка развертки — 1200 миллисекунд. Затем нажмите OK. Зажмите стеклянную заслонку с алюминиевым покрытием лицевой стороной в сторону катода.

Нажмите на кнопку запуска теста и наблюдайте за текущим измерением. После анодирования поверхности предметное стекло тщательно вымыть водой двойной дистилляции и высушить газообразным азотом. Храните предметное стекло в камере с относительной влажностью 30% до дальнейшего использования.

Для изготовления приготовьте 100 микролитров растворов всех одновалентных гликанов в этанолгликоле в концентрации 10 миллимоляров. Разбавьте растворы гликанов печатным буфером до получения 100 микромолярных растворов. Для исследования гетеролиганда добавьте пять микролитров гликана MAN-5 к пяти микролитрам каждого раствора гликанов.

Переложите подготовленные гликаны в микропланшет на 384 лунки для этапа печати микрочипов. После установки микропланшета на матрицу принтера печатайте микрочипы с помощью роботизированного штифта, нанося 0,6 нанолитра растворов гликанов на каждое стеклянное стекло с алюминиевым покрытием. Далее готовят 70 микролитров первичного антитела PG-9 и буфер ПТСБ, содержащий 3% БСА.

Затем в темноте приготовьте 120 микролитров вторичного флуоресцентного антитела Донки и античеловеческого иммуноглобулина G и PBST-буфера, содержащего 3% БСА. Смешайте PG9 и вторичное антитело флуоресцентной метки в соотношении 1:1. Затем инкубируйте предварительно смешанные антитела в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

После инкубации загрузите стеклянное стекло с алюминиевым покрытием в инкубационную камеру предметного стекла, которая разделена на 16 лунок. Перенесите 100 микролитров предварительно смешанных антител в гликановую решетку. После инкубации при четырех градусах Цельсия в течение 16 часов удалите предварительно смешанные антитела из гликановой матрицы с помощью пипетки, а затем снимите камеру для инкубации предметного стекла.

Промойте предметное стекло в PBST-буфере и деионизированной воде. Затем высушите стеклянное стекло при силе тяжести в 2000 раз. Затем откройте программное обеспечение для анализа изображений микрочипов.

Вставьте высушенное стекло в матрицу сканера таковыми элементами вниз. Нажмите на меню настроек. Установите разрешение изображения равным пяти микрометрам на пиксель.

Установите длину волны на 635 нанометров с помощью PMT 450 и мощность на 100%Нажмите кнопку сканирования, чтобы начать визуализацию предметного стекла. Наконец, нажмите на значок файла, чтобы сохранить изображение сканирования в формате TIF для анализа изображения. В этом исследовании широкий спектр N-гликанов был синтезирован с использованием модульной химиоферментативной стратегии.

Для демонстрации эффективности стратегии хемоферментативными методами была синтезирована биантенная изометрическая структура. Ферментативное галактозилирование дисахарида 1 с последующим фукозилированием трисахарида 2 давало желаемый тетрасахарид 3. При насыщении и восстановлении конечных модификаций строительного блока два и три, допускаются желательные молекулы четыре и пять.

Стереоселективное три О-гликозализалияние модуля 4 трисахарида 6 обеспечивало гексасахарид 7. Снятие защиты и реакция перед пятым модулем дали дедекасахарид девять. Глобальное обнаружение позволило получить гликан 10, который был охарактеризован энимаром и масс-спектроскопией.

Гликаны, содержащие пентиламиновый хвост на восстановительном конце, модифицировали линкерами фосфоновой кислоты и прикрепляли к поверхности, покрытой алюминиевым стеклом, с помощью фоспинидной химии. Широко нейтрализующее антитело к ВИЧ-1 PG9 было обследовано на специфичность гликанов с использованием массивов гомо- и гетерогликанов, чтобы впервые продемонстрировать его взаимодействие с соседними гетерогликанами в петле V1/V2 поверхности PG120 ВИЧ1. После освоения этой техники ее можно провести за 24 часа от иммобилизации гликана до бета-анализа, если она была выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать использовать для Glycan 10 стекло со свежеанодированным алюминиевым покрытием. Для укладки этой процедуры используются медицинские техники с помощью предметных стекол. Определение константы тела может быть выполнено для количественной оценки связывающих взаимодействий между углеводами и белками, представляющими интерес.

После разработки этого метода он проложил путь для исследователей, чтобы лучше понять роль углеводов в инфекционных заболеваниях в Кении и помочь разработать новые методы лечения заболеваний. Не забывайте, что работа с токсичными веществами может быть чрезвычайно опасной, и при проведении экспериментов всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение одежды, очков и масок.