Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления₂ H

Общая цель данного протокола заключается в исследовании активной побочной химии окислительно-восстановительного фермента гидрогеназы никель-железа как в условиях безоборотного, так и в стационарном электрокаталитическом обмене с использованием инфракрасной электрохимии белковой пленки или PFIRE. Основное преимущество метода PFIRE заключается в том, что он позволяет одновременно проводить точный электрохимический контроль и инфракрасный спектроскопический отбор проб окислительно-восстановительных белков, иммобилизованных на угольном электроде. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биофизики и биоэлектрохимии о том, какие состояния окислительно-восстановительного белка присутствуют во время стационарного каталитического оборота.

Чтобы начать процедуру, во влажном анаэробном бардачке суспензируйте 20 миллиграмм частиц технического углерода с большой площадью поверхности в одном миллилитре сверхчистой воды. Ультразвуком подвергайте суспензию при более низкой мощности в течение не менее 15 минут или до тех пор, пока частицы не будут равномерно диспергированы и в течение одного часа в состоянии покоя не образуется осадок. Затем загрузите 15 микролитров примерно семи миллиграммов на миллилитр раствора гидрогеназы E.Coli в центробежный фильтрующий блок мощностью 50 килодальтон.

Разбавьте раствор 450 микролитрами обменного буфера с низкой ионной силой с рН, близким к изоэлектрической точке гидрогеназы. Сконцентрируйте смесь до 50 микролитров путем центрифугирования при 27 000 раз изг. Повторно сконцентрируйте смесь еще четыре раза, чтобы завершить замену буфера.

Затем соедините пять микролитров дисперсии технического углерода в концентрации 20 миллиграммов на миллилитр с буферной водородазой. Храните смесь при температуре ноль градусов Цельсия в течение ночи, чтобы гидрогеназа впиталась в частицы технического углерода. Периодически проверяйте смесь для поддержания дисперсии частиц.

Центрифугируйте модифицированные частицы в концентрациях в 27 000 раз больше g и убедитесь, что надосадочная жидкость почти бесцветна, что указывает на хорошее поглощение водородазы частицами. Достижение высокого уровня поглощения имеет решающее значение для успеха эксперимента. Мы оптимизируем абсорбционный буфер, используя в качестве отправной точки буфер с низкой ионной силой при рН, близком к изоэлектрической точке белка.

Промойте частицы с помощью трех-пяти циклов центрифугирования и ресуспендирования в свежем обменном буфере. Сконцентрируйте смесь частиц примерно до пяти микролитров, чтобы достичь загрузки 20 миллиграммов на миллилитр частиц. Чтобы начать подготовку к проведению измерений PFIRE, очистите силиконовый внутренний отражающий элемент низкой мощностью ультразвуком в серной кислоте в течение 15 минут.

Затем азотная кислота в течение одного часа. Затем промойте элемент в сверхчистой воде и высушите его под струей сухого газообразного азота. Используйте силиконовый герметик электрического качества, чтобы закрепить IRE в опорной пластине аксессуара ATR с пятью отражениями, стараясь держать герметик по краям IRE.

Дайте герметику полностью высохнуть. Затем поместите опорную пластину в сухой анаэробный перчаточный ящик с ИК-прозрачным окошком рядом с ИК-Фурье спектрофотометром. Установите опорную пластину на аксессуар ATR.

Получение фонового спектра в режиме быстрого сканирования. Затем отсоедините опорную пластину аксессуара ATR и перенесите ее в влажный анаэробный перчаточный ящик. Равномерно нанесите один микролитр модифицированных ферментом частиц технического углерода на поверхность IRE, не давая частицам полностью высохнуть.

Важно, чтобы смесь модифицированных ферментами частиц была сконцентрирована до концентрации, максимально близкой к 20 миллиграммам на миллилитр. В противном случае может быть трудно добиться хорошо связанной пленки частиц при дроплитке частиц на этом этапе. Аккуратно положите кусок копировальной бумаги, смоченный в сверхчистой воде, на поверхность IRE, следя за тем, чтобы пленка от частиц была покрыта, не позволяя бумаге контактировать с силиконовым герметиком.

Установите специальную спектроэлектрохимическую ячейку над IRE. Добавьте 200 микролитров экспериментального буфера через входное отверстие для раствора, чтобы поддерживать гидратацию фермента во время подготовки системы. Подсоедините вход и выход раствора к флакону с экспериментальным буфером с помощью трубки перистальтического насоса.

Затем переложите собранную ячейку в бардачок для сушки. Установите элемент в сборе на принадлежность ATR и подсоедините трубку к перистальтическому насосу. Получите абсорбирующий спектр, используя ранее приобретенный спектр в качестве фона.

Убедитесь, что полосы MI2 хорошо видны на расстоянии 1 540 обратных сантиметров, а пики активного центра гидрогеназы обнаруживаются в области от 1 850 до 2 150 сантиметров. Чтобы подготовиться к эксперименту, приложите восстановительный потенциал отрицательного напряжения 0,8 вольта по отношению к насыщенному каломелевому электроду сравнения к пленке частиц. Насытите экспериментальный буфер анаэробным газообразным водородом.

Затем начните протекание буфера через спектроэлектрохимическую ячейку со скоростью около 12 миллилитров в минуту. Оставьте образец под потоком насыщенного водородом экспериментального буфера на ночь, чтобы активировать гидрогеназу. Получите абсорбирующий спектр активированного образца и убедитесь, что полосы CO и CN активного центра демонстрируют множественные редуцированные состояния.

Затем насытите экспериментальный буфер анаэробным газообразным азотом и пропустите буфер через ячейку. Подайте окислительный потенциал ноль вольт против насыщенного каломельного электрода сравнения в течение 30 минут и получите абсорбирующий спектр. Затем примените восстановительный потенциал на 30 минут и получите другой спектр.

Убедитесь, что фермент был полностью окислен, а затем восстановлен. Если нет, проверьте электрические соединения элемента. Используя анаэробный насыщенный водородом буфер, получить серию циклических вольтамперограмм при возрастающих скоростях потока, чтобы определить оптимальный расход для эксперимента.

Используя эту скорость потока, получить спектры в диапазоне потенциалов и условий решения. Измерения PFIRE гидрогеназы E.coli one были получены при различных потенциалах в инертной атмосфере и в присутствии газообразного водорода. Спектры, полученные в атмосфере водорода, представляли собой стационарное распределение активных состояний центра, присутствующих при каталитическом окислении водорода.

Затем исследовали анаэробное окисление и активацию гидрогеназы путем образования никель-B состояния из никель-Si путем получения спектров в различных временных точках во время потенциального применения и получения различных спектров относительно первого спектра. Наблюдаемое постепенное превращение никеля-Si в никель-B согласуется с монотонным уменьшением тока. Также были получены спектры для диапазона рН раствора для исследования этапов переноса протонов в каталитическом цикле гидрогеназы.

При низком pH никель-C-состояние было более распространенным, тогда как никель-L-состояние преобладало при высоком pH. Зависимость pH относительных концентраций никеля-C и никеля-L определялась на основе максимальных значений абсорбентов на соответствующих пиках при каждом рН, оцененном в эксперименте. Этот метод открывает исследователям в области биоэлектрохимии путь к изучению стационарной кинетики активации водорода путем гидрогенеза.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о типичном эксперименте PFIRE. Этот метод подходит для любого окислительно-восстановительного белка, который может быть изучен с помощью электрохимии белковой пленки, и добавляет прямое химическое понимание к электрохимическому измерению.