Оптическая когерентная томография: Визуализация мыши сетчатки ганглия клетки в естественных условиях

Общая цель данного эксперимента — использовать оптическую когерентную томографию (ОКТ) для быстрого и точного определения толщины сетчатки. ОКТ позволяет ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии, например, при изучении оптической нейропатии. Основным преимуществом данного метода является то, что он представляет собой неинвазивный способ выявления структурных изменений в ганглиозных клетках сетчатки мыши.

Этот метод представляет большой интерес, так как он является неинвазивным, безопасным и признанным способом тестирования эффективности лечения при оптической нейропатии. Для начала настройте параметры опорного плеча соответствующим образом в зависимости от линзы. Затем включите источник питания и компьютер.

Когда компьютер будет готов, запустите программу визуализации. Создайте новое клиническое исследование и добавьте необходимые протоколы. Перейдите в раздел обследования пациента и установите параметры обследования по умолчанию.

В разделе обследования пациентов нажмите «add patient», чтобы добавить нового пациента, и введите соответствующую информацию о нем. Затем нажмите «add exam», «start exam» и добавьте предварительно настроенные сканирования из списка, чтобы выбрать нужный протокол, начиная с глаза, который будет измеряться первым. Минимум за 15 минут до сбора данных закапайте в каждый глаз всех подопытных мышей капли 10% фенилэфрина комнатной температуры.

Затем удалите излишки реагента и закапайте капли 0,5% тропикамида комнатной температуры. Примерно за пять минут до начала регистрации данных введите общий наркоз. Сразу после этого в каждый глаз введите 0,4% гидрохлорида оксибупрокаина, выдержав раствор в течение трех секунд для анестезии и иммобилизации глаз.

Затем удалите капли и повторно закапайте 10% фенилефрин и 0,5% тропикамид. Когда зрачки расширятся достаточно для проведения визуализации, увлажните глаза вязкими каплями на основе гликоля для гидратации роговицы и оберните мышь в слой хирургической марли для сохранения тепла. С помощью губки или ватного тампона нанесите тонкий слой офтальмологического геля с добавлением 0,3% гипромеллозы на каждый глаз.

При этом отведите ресницы и вибриссы в сторону. Поместите мышь в кассету так, чтобы голова была расположена прямо и направлена вперед, и осторожно зафиксируйте рот с помощью прикусочной планки. Подложите ватный валик под бок животного со стороны исследуемого глаза.

Затем, удерживая зажим на наводке специфического объектива для мышей, вращайте винт транслятора по оси z против часовой стрелки, чтобы приблизить объектив к глазу. Задайте положение мыши, поворачивая и вращая кассету, а также подкручивая прикусную планку и винты транслятора по оси x, пока исследуемый глаз не будет расположен так, чтобы смотреть прямо в объектив. Когда оптические оси глаз и объектива будут выровнены, выберите первый скан в исследовании.

Нажмите «start aiming» и используйте винт z-транслятора, чтобы переместить сетчатку по вертикали в левой панели и по горизонтали в правой панели. Поворачивая кассету, переместите головку зрительного нерва вверх или вниз, чтобы центрировать ее в правой панели. Используйте винт зажимной планки, чтобы выровнять сетчатку в правой панели, и разверните кассету так, чтобы головка зрительного нерва оказалась посередине левой панели.

Затем с помощью винта перемещения по оси x выровняйте сетчатку внутри левой панели и, учитывая основную функцию каждого модулятора, дополнительно отрегулируйте положение сетчатки для идеального центрирования по головке зрительного нерва. Когда сетчатка будет positioned, нажмите «start snapshot», чтобы начать сканирование методом оптической когерентной томографии в спектральной области. Не забудьте сохранить скан и отчет.

При необходимости отрегулируйте центрирование. По завершении сканирования отведите линзу и позиционируйте второй глаз так же, как было продемонстрировано ранее. После сканирования второго глаза извлеките мышь из кассеты, нанесите в каждый глаз офтальмологический гель с 0,3% гипромеллозой и поместите животное на подогреваемую платформу под наблюдением до полного восстановления.

Для фокусировки на ганглиозных клетках сетчатки используйте макрос MRI retina tool, созданный для ImageJ. Откройте MRI retina tool, выберите инструмент полигонального выделения (polygon selection tool) и загрузите интересующее изображение. Нажмите M, чтобы начать измерение, затем нажмите E для корректировки горизонтального положения. Выберите первую кассету в недавно открывшемся окне менеджера областей интереса (region of interest manager window).

Нажмите на синий многоугольник и кликните по границам измеряемого слоя на изображении, чтобы отрегулировать положение первой кассеты. Выберите вторую кассету в окне менеджера областей интереса (region of interest manager) и отрегулируйте ее положение. Затем нажмите R, чтобы повторно измерить сетчатку и просмотреть результаты в окне измерений.

Несмотря на то, что качество сканирования ОКТ в спектральной области уступает качеству изображения поперечного сечения сетчатки, ОКТ позволяет визуализировать большее количество слоев. Слои сетчатки легко измеряются при ОКТ-сканировании и включают слой ретинальных нервных волокон и ганглионарных клеток, внутренний ядерный слой, внешний сплетениевой слой, внешний ядерный слой, слои внутренних и внешних сегментов, ретинальный пигментный эпителий и хориоидею, что позволяет проводить комплексное исследование всей сетчатки. Продемонстрированное измерение толщины сетчатки с помощью ОКТ показывает, что у генетически мутантных самок мышей OPA1 с нарушениями зрения наблюдается прогрессирующее утолщение комплекса ганглионарных клеток и перипапиллярных слоев ретинальных нервных волокон.

Сравнение толщины слоя нервных волокон сетчатки в слое ганглионарных клеток с использованием стандартных и самодельных штангенциркулей показывает, что стандартные приборы дают значительно меньшие значения толщины, поскольку они намного массивнее, и их сложнее установить на границе тонкого слоя. После освоения эта методика может быть выполнена за 15 минут при правильном подходе. Разработка ОКТ открыла исследователям в области офтальмологии путь к анализу структурных изменений сетчатки мыши.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить ОКТ-визуализацию ганглиозных клеток сетчатки мышей и анализировать полученные результаты.