Новые методы изучения кодирования вкуса

Общая цель данных методов заключается в изучении вкусового кодирования у простого животного mandi-casecsta путем записи активности нескольких рецепторных нейронов in vivo при одновременном подаче и мониторинге точно рассчитанных по времени импульсов вкусовых стимулов. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы о вкусовом восприятии, например, о том, как вкусовые раздражители кодируются популяциями вкусовых рецепторных нейронов. Основным преимуществом данной методики является возможность проведения записей in vivo от нескольких вкусовых нейронов до, во время и после подачи точно дозированных вкусовых стимулов.

Лицам, которые впервые используют данный метод, процедура может показаться сложной из-за сложности процесса диссекции. В связи с этим мы надеемся, что визуальная демонстрация метода окажется полезной. Эти методы были разработаны Сэмом Райтером, когда он был аспирантом в моей лаборатории, совместно с Алехандрой; Куи Сун продемонстрирует данные процедуры.

Через три дня после вылета из кокона выберите мотылька любого пола, имеющего здоровый внешний вид. Крылья должны быть полностью расправлены, хоботок и антенны — хорошо сформированы и не повреждены. В вытяжном шкафу поместите выбранного мотылька в удерживающую трубку так, чтобы была открыта только голова.

Затем иммобилизируйте моль, вставив салфетку в другой конец трубки. Теперь, используя струю сжатого воздуха из шприца, удалите волоски с открытой части головы. После этого поместите трубку на глиняную платформу в чашке Петри.

Положите голову спинной стороной вверх. Затем защитите антенны и хоботок. Для этого из наконечников дозатора объемом 200 µL вырежьте колпачки длиной 0,5 см для каждой из этих структур.

Для манипуляций с хоботком изготовьте крючок из кусочка проволоки. Вытяните хоботок в один из колпачков так, чтобы была зафиксирована его самая проксимальная часть. Закрепите трубку на дорсальной стороне головной капсулы с помощью плотного батика (воска).

Затем осторожно зафиксируйте антенны и закрепите трубки с помощью батик-воска. Теперь стабилизируйте мозг, перерезав мышцу компрессора хоботка. Под диссекционным микроскопом с помощью инструментов для микродиссекции вскройте головную капсулу, сделав небольшой разрез непосредственно под хоботком.

Чтобы подтвердить перерез мышцы, предложите раствор сахарозы дистальным двум третям хоботка и в течение пяти минут убедитесь, что хоботок не выдвигается. Затем закройте головную капсулу слоем расплавленного батика. Для перфузии мозга физиологическим раствором соорудите восковую чашку вокруг вентральной стороны головы.

С помощью электрического воскового дозатора начните формировать восковую чашу вдоль передней части головы, перемещаясь к задней. Хоботок и трубки антенн должны оставаться внутри чаши. Продолжайте наращивать чашу наружу и вверх, пока она не достигнет уровня глаз.

С помощью пинцета возьмите лабиальные пальпы и закрепите их в восковом стаканчике, используя расплавленный воск. Затем загерметизируйте все отверстия в восковом стаканчике и трубках, нанеся тонкий слой двухкомпонентного эпоксидного клея. Перемешайте эпоксидный клей с помощью зубочистки.

Сначала покройте внешнюю и внутреннюю поверхности чашки. Затем заполните часть фиксирующей трубки вокруг шеи, чтобы голова удерживалась более надежно. Через 20 минут проверьте чашку на наличие утечек.

Для начала операции на мозге сначала удалите лабиальные щупики. Чтобы открыть вентральную сторону головной капсулы, разрежьте кутикулу вдоль задней и передней части головы, а также вокруг глаз. Затем сделайте разрез по задней части головы и дополнительные разрезы по передней части головы рядом с хоботком.

Затем осторожно приподнимите лоскут кутикулы пинцетом, чтобы обнажить головной мозг. Теперь выполните самый ответственный этап — обнажение SEZ и верхнечелюстных нервов. Медленно и аккуратно удалите жировую ткань и трахею.

Часто промывайте мозг свежим физиологическим раствором. Будьте предельно осторожны, так как верхнечелюстные нервы очень легко раздавить. Когда SEZ и верхнечелюстные нервы станут окончательно видны, они будут покрыты тонкой оболочкой.

Чтобы удалить эту оболочку, слейте излишки физиологического раствора, а затем размягчите оболочку, нанеся 10% раствор коллагеназы диспазы. После вымачивания в течение пяти минут несколько раз промойте область физиологическим раствором для удаления препарата. Затем, после нескольких промывок физиологическим раствором, осторожно удалите оболочку с помощью сверхтонких микродиссекционных пинцетов.

Наконец, закрепите линию капельного введения физиологического раствора в перфузионную чашку. В данном разделе описывается способ создания и использования системы подачи tastants. Система состоит из испытательной трубки с несколькими отверстиями.

Отверстия служат для входа хоботка животного, различных вкусовых раздражителей и датчика цвета, а также обеспечивают прохождение воды. Чтобы создать такую систему, сначала подготовьте пробирку для хоботка. С помощью паяльника проделайте отверстие соответствующего размера под хоботок.

Затем создайте внутри трубки секцию с сеткой, чтобы зафиксировать хоботок. Сделайте разрез на пять миллиметров выше отверстия, закрепите там сетку с помощью воска и снова соедините трубки, используя воск и эпоксидную смолу. Для подачи вкусовых стимулов используйте систему перфузии под давлением.

Подсоедините к коллектору столько трубок с tastant-растворами, сколько потребуется. Чтобы подсоединить выходную трубку, сделайте отверстие примерно в одном сантиметре над сеткой, затем закрепите выходную трубку эпоксидным клеем. В каждый tastant-раствор добавьте искусственный краситель для регистрации датчиком цвета.

Прикрепите датчик цвета к аппарату в отверстии на расстоянии половины сантиметра от сетки и зафиксируйте его с помощью эпоксидного клея. Используйте перистальтический насос для подачи дистиллированной воды в систему через силиконовую трубку. Соберите отработанную воду в большую емкость.

Используйте пневматический насос для подачи вкусовых стимулов с помощью воздушных импульсов. Теперь начните перекачку чистой воды по трубкам и подавайте импульсы вкусового стимула для проверки датчика цвета. Затем поместите две трети хоботка мотылька в измерительную трубку.

С помощью пинцета вытяните хоботок и осторожно вставьте его в отверстие. Затем зафиксируйте хоботок на месте с помощью мягкого стоматологического воска и слоя эпоксидной смолы. Теперь подключите линию перфузии физиологическим раствором и установите скорость потока перфузии.

Затем погрузите заземляющий электрод скрученного проволочного тетрода в солевой раствор. После этого с помощью микроманипулятора расположите тетрод рядом с верхнечелюстным нервом и медленно введите его в нерв. После обнаружения спайковых сигналов дайте препарату стабилизироваться в течение как минимум 10 минут перед началом записи.

Регистрация активности вкусовых рецепторных нейронов проводилась до, во время и после подачи вкусовых стимулов согласно описанному протоколу. Начало и окончание односекундного импульса каждого стимула контролировалось с помощью датчика цвета. Вкусовые стимулы вызывали спайки, которые регистрировались каждым из четырех каналов.

В сериях спайков можно было наблюдать отдельные потенциалы действия. Для сопоставления этих спайков с конкретными нейронами использовалось программное обеспечение для сортировки спайков. Ответ трех различных вкусовых рецепторных нейронов на шесть tastants, подаваемых последовательно, демонстрирует разные уровни базовой активности и селективность к tastants.

Кроме того, ответы различались по времени. Некоторые из них были ограничены длительностью стимула, в то время как другие продолжались дольше его действия. Внутриклеточная регистрация также могла проводиться с аксонов вкусовых рецепторов с использованием обычных острых стеклянных электродов.

Результаты внутриклеточных записей были очень схожи с ответами, наблюдаемыми при использовании описанного метода с тетродом, однако записи с помощью тетрода было проще выполнять, они были более длительными и стабильными. После просмотра этого видео вы сможете обнажить верхнечелюстные нервы и субэзофагальную зону у mandi-casecsta, а также создать систему подачи tastant с точным временным контролем. При выполнении данного протокола используйте лабораторные защитные перчатки и маску для лица, так как мелкая порошкообразная чешуя, сбрасываемая mandi-casecsta, может быть аллергеном.

После освоения данная процедура может быть выполнена за три с половиной часа. После проведения этой процедуры также можно осуществлять одновременную запись из нескольких областей мозга для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о том, как ответы вкусовых рецепторных нейронов на вкусовые стимулы трансформируются при их передаче на постсинаптические таргетные нейроны.