Новые методы изучения кодирования вкуса

Общая цель этих методов заключается в изучении вкусового кодирования в простом животном-казексте путем регистрации активности нескольких рецепторных нейронов in vivo, при этом доставляя и контролируя точно синхронизированные импульсы вкусовых веществ. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы о дегустации, например, о том, как дегустаторы кодируются популяциями нейронов вкусовых рецепторов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет записывать in vivo несколько вкусовых нейронов до, во время и после точно доставленных вкусовых стимулов.

Люди, плохо знакомые с этим методом, могут найти его сложным, потому что процедура вскрытия сложна. В связи с этим мы надеемся, что наглядная демонстрация метода будет полезной. Эти методы были разработаны Сэмом Райтером, когда он был аспирантом в моей лаборатории, вместе с Алехандрой Куй Сун продемонстрирует эти процедуры.

Через три дня после эклозии выбирают бабочку любого пола, которая имеет в целом здоровый вид. Крылья должны быть полностью вытянуты, а хоботок и усики должны быть хорошо сформированы и неповреждены. В вытяжной шкаф вставьте выбранную бабочку в удерживающую трубку до тех пор, пока головка не обнажится.

Затем обездвижите моль, вставив папиросную бумагу в другой конец трубки. Теперь с помощью сжатого воздуха, подаваемого из шприца, удалите волосы с обнаженной головы. Затем поместите трубку на глиняную платформу в чашку Петри.

Ориентируйте голову спинной стороной вверх. Далее защитите усики и хоботок. Сначала сделайте для каждой конструкции крышки из 200 микролитровых наконечников пипетки, нарезанных на полусантиметровые длины.

Чтобы манипулировать хоботком, подготовьте крючок из куска проволоки. Протяните хоботок в одну из крышек до тех пор, пока самая проксимальная часть хоботка не будет защищена. Закрепите трубку на спинной части капсулы головы с помощью твердого воска батик.

Далее тщательно пролистывайте усики и закрепляйте трубочки воском батик. Теперь стабилизируйте мозг, разрезав мышцу компрессора пряжки. Под микроскопом для препарирования с помощью инструментов микродиссекции вскройте капсулу головки, сделав небольшой надрез чуть ниже хоботка.

Чтобы убедиться в том, что мышца рассечена, предложите раствор сахарозы дистальным отделом двух третей хоботка, и в течение пяти минут следите за тем, чтобы хоботок не растягивался. Затем закройте капсулу головы с помощью слоя расплавленного воска батик. Чтобы перфузировать мозг физиологическим раствором, соорудите восковую чашу вокруг вентральной стороны головы.

Используя электрический восковой аппарат, начните строить восковую чашу вдоль передней части головы, двигаясь к задней части. Держите хоботок и трубки для усиков внутри чашки. Продолжайте наращивать чашу наружу и вверх, пока она не достигнет уровня глаз.

С помощью щипцов возьмите губные пальпы и прикрепите их к восковой чашечке с помощью расплавленного воска. Затем запечатайте все отверстия в восковой чашке и трубках с помощью слоя бинарной эпоксидной смолы. Смешайте эпоксидную смолу с помощью зубочистки.

Сначала накройте наружную и внутреннюю поверхности чашки. Во-вторых, заполните часть удерживающей трубки, окружающую шею, чтобы голова удерживалась более прочно. Через 20 минут проверьте чашку на герметичность.

Чтобы начать операцию на головном мозге, сначала отрежьте губные пальпы. Чтобы открыть вентральную сторону капсулы головы, разрежьте кутикулу вдоль задней и передней части головы и вокруг глаз. Затем разрежьте вдоль затылка и сделайте еще надрезы вдоль передней части головы возле хоботка.

Затем аккуратно приподнимите лоскут кутикулы с помощью щипцов, чтобы обнажить мозг. Теперь выполните самый ответственный шаг, обнажив ОЭЗ и верхнечелюстные нервы. Медленно и осторожно удалите жировую ткань и трахею.

Часто промывайте мозг свежим солевым раствором. Будьте очень осторожны, ведь раздавить верхнечелюстные нервы очень легко. Когда СЭЗ и верхнечелюстные нервы будут окончательно видны, они будут покрыты тонкой оболочкой.

Чтобы удалить эту оболочку, слейте излишки физиологического раствора, а затем ослабьте оболочку, применив 10% раствор диспазы коллагеназы. Замочив на пять минут, смойте раствор несколько раз солевым раствором. Затем, после нескольких полосканий солевым раствором, аккуратно снимите влагалище с помощью сверхтонких микродиссекционных щипцов.

Наконец, вставьте капельницу с солевым раствором в перфузионную чашку. В этом разделе описывается, как создать и использовать систему доставки вкусовых веществ. Система состоит из пробирки с несколькими отверстиями.

Отверстия обеспечивают вход для хоботка животного, многообразия вкусовых веществ, цветового сенсора, а также пропускают флор через воду. Чтобы построить эту систему, сначала подготовьте пробирку для хоботка. Сделайте отверстие размером с хоботок с помощью паяльника.

Затем создайте экранированный участок внутри трубки, чтобы удерживать хоботок на месте. Вырежьте отверстие на пять миллиметров, поместите туда сетку с воском и снова соедините трубки с помощью воска и эпоксидной смолы. Используйте систему перфузии под давлением для подачи вкусовых веществ.

Соедините столько трубок, сколько необходимо, к коллектору. Чтобы подключить выходную трубку, сделайте отверстие примерно на один сантиметр над сеткой, затем закрепите к нему выходную трубку эпоксидной смолой. В каждый тест включите искусственный краситель, который должен быть обнаружен датчиком цвета.

Прикрепите к аппарату датчик цвета в отверстии в полусантиметре от сетки, и закрепите его там с помощью эпоксидной смолы. Используйте перистальтический насос для подачи дистиллированной воды в систему по силиконовым трубкам. Собирайте сточные воды с помощью большой емкости.

Используйте пневматический насос для подачи вкусовых добавок с помощью воздушных потоков. Теперь начните закачивать чистую воду через трубки и подайте импульсы вкуса для проверки датчика цвета. Теперь загрузите две трети хоботка от моли в пробирку.

С помощью щипцов вытяните хоботок и аккуратно протолкните его в отверстие. Затем запечатайте хоботок на месте мягким стоматологическим воском и слоем эпоксидной смолы. Теперь подключите линию перфузии физиологического раствора и настройте поток перфузии.

Затем погрузите заземляющий электрод скрученной проволоки тетрод в солевую ванну. Затем с помощью микроманипулятора расположите тетрод рядом с верхнечелюстным нервом и медленно продвигайте его внутрь нерва. После обнаружения пиковых сигналов дайте препарату стабилизироваться в течение как минимум 10 минут, прежде чем делать записи.

Записи были сделаны с вкусовых рецепторных нейронов до, во время и после доставки вкуса с использованием описанного протокола. Начало и смещение импульса в одну секунду каждого теста контролировалось с помощью цветового датчика. Дегустаторы вызывали всплески, которые были обнаружены каждым из четырех каналов.

Внутри спайковых цепей можно было наблюдать индивидуальные потенциалы действия. Программное обеспечение для сортировки спайков использовалось для присвоения этих спайков уникальным нейронам. Реакция трех различных вкусовых рецепторных нейронов на шесть вкусовых рецепторов, подаваемых последовательно, показывает различные уровни исходной активности и селективности по отношению к вкусовым веществам.

Кроме того, ответы имели разное время. Некоторые из них привязаны к длительности стимула, в то время как другие переживают его дольше. Внутриклеточные записи также могут быть сделаны с аксонов вкусовых рецепторов с помощью обычных острых стеклянных электродов.

Внутриклеточные записи были очень похожи на ответы, наблюдаемые с помощью описанной техники тетрода, но записи тетрода были проще в изготовлении, более долговечными и более надежными. После просмотра этого видео вы сможете обнажить верхнечелюстные нервы и подпищеводную зону в нижней челюсти-казексте, а также сможете построить систему доставки тастанта с точным временным контролем. Выполняя этот протокол, надевайте лабораторные защитные перчатки и маску для лица, потому что мелкодисперсная чешуйчатая оболочка может быть аллергенной.

После освоения эта процедура может быть завершена за три с половиной часа. После этой процедуры также могут быть выполнены одновременные записи из нескольких областей мозга, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как как трансформируются реакции вкусовых рецепторных нейронов на вкусовые сигналы, когда они передаются постсинаптическим нейронам-мишеням.