PIP-on-a-chip: безвредное исследование взаимодействия протеин-фосфоинозитид

Общая цель анализа PIP-on-a-chip заключается в количественной оценке взаимодействия белковых мембран количественным способом без меток. Взаимодействия белковых мембран лежат в основе многих процессов в клетке и ее патогенах, но методов изучения этих взаимодействий мало. Преимущества этого метода заключаются в малом простом объеме, отсутствии требований к мечению лигандов или рецепторов в сочетании с возможностью тестирования мембранных взаимодействий физиологически значимым образом.

Многими терапевтическими мишенями вирусов являются мембранные белки, исследования этих белков-мишеней часто проводятся в растворе с использованием детергентов. Наша методика предлагает более биологически значимую альтернативу. Хотя вы увидите, что этот анализ способен отслеживать взаимодействие белков с мембранами, на самом деле это довольно универсальный анализ, который может быть использован для мониторинга взаимодействий мембран железа, низкомолекулярных мембран и даже пептидных мембран

Для начала смешайте полидиметилсилоксан или преполимер PDMS и отвердитель в соотношении 10:1 в большой пластиковой лодке для взвешивания. Дегазируйте смесь в вакууме в течение одного часа с силой вакуума 500 тор или менее. Поместите силиконовый мастер, который содержит несколько реплик одного и того же микрорисунка SU8, в большую пластиковую лодку для взвешивания и залейте дегазированный PDMS, а затем отверждите его в сухой духовке при температуре 60 градусов Цельсия на ночь.

На следующий день аккуратно отклейте PDMS от силиконового мастера руками. Обозначьте границы каждого микроузора в прямоугольниках с помощью хирургического скальпеля и линейки. Затем разрежьте PDMS на блоки, проделайте 16 отверстий на обоих концах каждого микроканала с помощью биопсийного перфоратора, чтобы сделать отверстия диаметром 1,0 миллиметра.

Пипетка рассчитывала объемы фосфатидилхолина, фосфатидилинозитола 4, 5-бисфосфата и чувствительного к pH флуоресцентного зонда в одном стеклянном вентиляционном флаконе объемом 20 миллилитров. Высушите смесь в потоке газообразного азота внутри вытяжного шкафа для химикатов в течение 10 минут или до тех пор, пока растворитель не испарится и на дне флакона не образуется тонкая липидная пленка. Затем высушите смесь под вакуумом в течение не менее трех часов при крепости вакуума 10 миллитор, чтобы удалить остатки органического растворителя.

Высохшую липидную пленку регидратировать пятью миллилитрами проточного буфера, поместить регидратированный липид в ультразвуковую ванну с рабочей частотой 35 килогерц на 30 минут при комнатной температуре. Заморозьте, разморозьте везикулу суспензией с жидким азотом и на водяной бане при температуре 40 градусов Цельсия, чтобы получить однослойные везикулы. Повторите замораживание размораживания 10 раз, выдавите суспензию везикул на поликарбонатную мембрану с направляющей кромкой 0,1 мкм, используя липидный экструдер для обогащения мелких односторонних везикул.

Повторите выдавливание 10 раз. Проверьте входные и выходные отверстия блока PDMS на предмет засорения, впрыскивая через отверстия деионизированную воду с помощью бутылки для промывки воды, затем высушите блок PDMS газообразным азотом. Затем поместите блок PDMS и предварительно очищенную защитную крышку внутрь камеры для образцов кислородной плазменной системы.

Выставьте блок PDMS и крышку с кислородной плазмой на 45 секунд с настройками мощности 75 Вт, скоростью потока кислорода 10 кубических сантиметров в минуту и силой вакуума 200 миллитор. Далее сразу после кислородной плазменной обработки поместите поверхность шаблона блока PDMS в контакт с защитным стеклом. Осторожно нажмите, чтобы удалить пузырьки воздуха в местах контакта.

Поместите устройство на ровную горячую плиту при температуре 100 градусов Цельсия на три минуты, чтобы усилить сцепление. Используйте влажную безворсовую салфетку со 100% этанолом, чтобы удалить любые частицы пыли с верхней и нижней части устройства. Затем прикрепите устройство скотчем к стеклянному предметному стеклу микроскопа.

Перенесите 100 микролитров фосфатидилинозитола 4, 5-бисфосфата, содержащих мелкие униламинарные везикулы, в микроцентрифужную пробирку объемом 0,65 миллилитров. Отрегулируйте pH раствора примерно до 3/2, добавив 6,4 микролитра 0,2 нормальной соляной кислоты. Пипеткой подайте 10 микролитров отрегулированного по pH раствора небольшого униламинарного везикулы в каждый канал через входное отверстие и надавливайте через пипетку до тех пор, пока раствор не достигнет выходного отверстия.

Отсоедините наконечник от пипетки и оставьте его прикрепленным к устройству. Повторив этот шаг для каждого канала, инкубируйте устройство в течение 10 минут при комнатной температуре, введение везикул в микроканалы следует выполнять сразу после сборки устройства. Тем временем отрежьте наборы входных и выходных трубок с помощью пинцета, подсоедините набор входных и выходных трубок к устройству, а затем прикрепите устройство к предметному столику для микроскопа.

Погрузите один конец входной трубки в 25 миллилитров рабочего буфера, содержащегося в конической трубке, и обмотайте его лентой, чтобы убедиться, что трубка надежно закреплена. С помощью лабораторного домкрата поместите коническую трубку на возвышенность, чем устройство, чтобы раствор проталкивался через микроканалы под действием силы тяжести. Для каждой впускной трубки с помощью шприца наберите один миллилитр рабочего буфера со свободного конца трубки.

Извлеките наконечник пипетки из впускного отверстия и вставьте свободный конец впускной трубки в устройство. Повторите этот процесс, чтобы подсоединить все части входной трубки к устройству. Протекающий проточный буфер через каналы помогает удалить избыток неразорвавшихся пузырьков и уравновесить бислой до экспериментальных условий.

Далее откройте программное обеспечение для управления микроскопом. На левой панели нажмите на вкладку «Микроскоп» и выберите объектив с 10-кратным увеличением. Нажмите на живые, а затем на иконки изображений Alexa 568 на панели инструментов, используя ручки тонкой и грубой регулировки, сосредоточьтесь на микроканалах.

Просканируйте устройство, чтобы проверить качество SLB и каналов. Затем нажмите на значок закрытого изображения затвора FL на панели инструментов, перейдите на вкладку съемки и в разделе «Основные настройки» выберите время экспозиции. Установите время экспозиции на 200 миллисекунд.

На левой панели нажмите на «Многомерное получение». В меню фильтров выберите красный канал. Затем нажмите на меню таймлапса, установите временной интервал на пять минут, продолжительность на 30 минут и меню таймлапса.

Выберите инструмент «Круг» на вкладке «Измерение» и нарисуйте круг в любом канале. Щелкните правой кнопкой мыши, когда круг выделен, и выберите свойства. На вкладке профиля отметьте все T, чтобы увидеть интенсивность флуоресценции в зависимости от времени.

Убедитесь, что эта кривая достигает плато, которое указывает на равновесие, прежде чем переходить к следующему шагу, опустите буферный раствор до такой же земли, как устройство, чтобы остановить поток. По одному отсоедините каждую выходную трубку и внесите по 200 микролитров каждого разбавления белка в выходной канал с помощью пипетки. Не давите, позвольте силе тяжести сделать свою работу.

Отсоедините наконечник от пипетки и оставьте его прикрепленным к микрофлюидному устройству. Повторите этот процесс для каждого канала и убедитесь, что во время этого процесса в каналы не попадают пузырьки воздуха. Затем опустите входную трубку на землю под микрофлюидным устройством, чтобы начать подачу белка по микроканалам.

Прикрепите свободный конец трубки к контейнеру для отходов. Протекайте разведениями домена гомологии плекстрина в течение 30 минут. На левой панели программного обеспечения на вкладке таймлапса нажмите «Пуск», чтобы снова начать создание образа.

Здесь представлен репрезентативный вид фосфатидилинозитол 4, 5-бисфосфатсодержащих SLB в микроканалах. До и после, добавляя домен гомологии плекстрина в указанных концентрациях. Интенсивность флуоресценции от линии, сканированной по микроканалам, построена в зависимости от расстояния и пикселей для экспериментов по связыванию фосфатидилхолина, фосфатидилинозитола 4 и фосфатидилинозитола 4, 5-бисфосфата.

Затем нормализуются данные связывания из отдельных экспериментов, строится график в зависимости от концентрации домена гомологии гомологии фосфолипазы C 1 плекстрина и подгоняется под изотерм связывания для извлечения кажущихся ассоциативных констант. Сравнение кажущихся ассоциативных констант показывает, что домен гомологии плекстрина фосфолипазы C Delta 1 взаимодействует с фосфатидилинозитолом 4, 5-бисфосфатом, как и ожидалось. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создавать небольшие униламинарные везикулы, создавать микрофлюидные устройства, формировать поддерживаемые липидные бислои внутри этих микрофлюидных устройств, как ваши взаимодействия связывания белковой мембраны, используя этот анализ с нашим подходом PIP-on-a-chip.

После освоения этой техники ее можно сделать за три часа, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, чтобы оценить влияние связывания белковой мембраны на латеральную диффузию липидов. Этот метод прокладывает путь к изучению взаимодействий белковых мембран со сборкой липидов, обнаруженных в клетках, а не по одному, поэтому этот подход окажет широкое влияние на биохимию и клеточную биологию взаимодействия белковых мембран.