Анализ зависимой от разрыва связи переноса miRNA с помощью 3D-FRAP-микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании зависимого от щелевого соединения переноса микроРНК в живых кардиомиоцитах. Этот метод может помочь решить вопрос о роли микроРНК в системе передачи межклеточного сигнала. Основное преимущество этого метода заключается в том, что обмен микроРНК через щелевое соединение может быть визуализирован и количественно определен в живых клетках с высоким пространственно-временным разрешением.

После выделения кардиомиоцитов в соответствии с текстовым протоколом поместите клетки на шесть луночных планшетов с плотностью от трех до 10 до пятой клетки на квадратный сантиметр. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день добавьте 0,5 трипзина в клетки и инкубируйте культуры в течение пяти минут, чтобы отделить клетки.

Инактивируйте трипзин путем добавления среды для культивирования клеток. После подсчета клеток центрифугируйте их при 300 умноженных на g в течение 10 минут. Затем с помощью электропорационного буфера повторно суспендируют клетки в соотношении от четырех до 10 до пятой части на 100 микролитров.

Далее смешайте в пробирке 100 микролитров клеточной суспензии с флуоресцентной микроРНК и загрузите смесь в кювету для электропорации. Затем проведите электропорацию с помощью программы G009 на электропораторе. Добавьте 500 микролитров предварительно подогретой среды для клеточных культур и перенесите весь объем клеточной суспензии в лунку четырехлуночного стекла стеклянной нижней камеры.

Культивируйте клетки в течение одного дня при температуре 37 градусов по Цельсию в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. Предварительно прогрев микроскопа-инкубатора и включив конфукальную систему, вставьте предметное стекло камеры в держатель образца предмета. Используйте масляный объектив с молекулярным сопротивлением 1,4 нА и лазерное возбуждение 561 нм при низкой мощности лазера с диапазоном обнаружения от 570 до 680 нанометров, чтобы найти кластер трансвекцированных кардиомиоцитов.

Далее в диспетчере настроек активируйте кнопки z-стека, временного ряда, отбеливания и регионов. Затем, чтобы определить параметры frap, в меню режима сбора данных установите размер кадра 512 на 512, шаг линии — единицу, а время сканирования — менее одной секунды. В меню каналов отрегулируйте мощность лазера, смещение и усилие для получения максимальной флуоресценции при минимальном возбуждении лазера, чтобы избежать насыщения интенсивностью.

Затем установите размер отверстия на два микрометра. Затем в меню регионов выберите инструмент рисования roy и с помощью курсора отметьте целевую ячейку, ячейку привязки и область фона. При необходимости выберите несколько целевых ячеек для фотообесцвечивания.

В меню «Отбеливание» отрегулируйте параметры фотоотбеливания. Затем в меню z-стека определите пределы для получения z-стека в зависимости от толщины ячеек. Отрегулируйте количество слоев z до 12 tp 15, затем начните эксперимент с frap и запишите восстановление флуоресценции.

Для анализа данных необходимо создать максимальную проекцию полученных z-стеков с помощью специального программного обеспечения микроскопа, нажать кнопку «Обработка», «Проекция максимальной интенсивности», выбрать файл, применить. Наконец, скопируйте данные об интенсивности флуоресценции во всех временных точках из цели, фона и контрольной ячейки в электронную таблицу и выполните анализ данных в соответствии с текстовым протоколом. Здесь показаны изолированные кардиомиоциты с типичным поперечно-полосатым рисунком альфа-актинина и большими бляшками коннексина43 вдоль межклеточных границ.

Некоторые некардиомиоциты присутствовали в культуре. Как видно на рисунке, с помощью проточной цитометрии была достигнута эффективность трансвекции 45%. Кроме того, в исследовании «живой-мертвый» было выявлено, что большинство клеток продемонстрировали высокую жизнеспособность, что важно при анализе связи между зазорами.

Для анализа FRAP клетки-мишени выбираются внутри клеточного кластера и подвергаются фотообесцвечиванию со 100% мощностью лазера, что приводит к снижению флуоресценции микроРНК в выбранных клетках. Количественный анализ и нормализация полученных данных показали среднее восстановление на 20%В этом эксперименте миРНК опосредованный нокдаун коннексина43 привел к снижению экспрессии белка и ингибированию щелевой соединительной коммуникации. Восстановление флуоресценции было снижено более чем на 50%, что указывает на то, что эффективность переноса РНК miro сильно зависит от щелевой соединительной связи между клетками.

На этом рисунке показана 3D-визуализация поверхности эксперимента с фрапом. По сравнению с максимальными проекциями, получение z-стеков может быть использовано для создания 3D-реконструкций для исследования локализации и мобильности микроРНК в клетках. После освоения FRAP измерения могут быть выполнены за два-три часа, если они выполнены правильно.

При проведении этой процедуры важно выбрать клетки-мишени, которые имеют аналогичное количество соседних клеток. Кроме того, параметры обесцвечивания и условия получения изображения должны быть выбраны так, чтобы избежать фототоксических эффектов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как использовать микроскопию FRAP, чтобы количественно оценить и визуализировать движение микроРНК внутри клеточных кластеров.