Одновременное измерение HDAC1 и HDAC6 активности в НеЬа клетки с помощью UHPLC-MS

Общая цель этого метода заключается в определении ингибиторного потенциала соединений HDAC и выявлении селективности по отношению к HDAC6 или HDAC1 в клетках с помощью одного масс-спектрометрического анализа на основе ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки лекарств, такие как определение того, является ли ингибитор HDAC селективным по отношению к HDAC6 по сравнению с HDAC класса I в живых клетках. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он требует одной стадии инкубации с клетками, ингибиторами и селективными субстратами для определения активности против двух изоформ HDAC одновременно.

Применение этого метода распространяется на раннее открытие лекарств селективных ингибиторов HDAC, поскольку он определяет, сохраняется ли селективность HDAC6 в живых клетках в обход анализов эндогенного ацетилирования белков. Хотя этот метод оценивает селективность ингибиторов HDAC в клетках HeLa, он также может быть применен к другим клеточным линиям, таким как первичные и другие опухолевые клетки, включая клинические образцы. Культивируйте клетки HeLa до 80% конфлюенции в колбе для клеточной культуры T75 в минимальной эфирной среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина G и стрептомицина.

Дважды промойте клетки пятью миллилитрами фосфатно-солевого буфера Дульбекко. Затем аспирируйте буфер и добавьте один миллилитр реагента для диссоциации клеток. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы отделить клетки.

Через пять минут добавьте в клетки девять миллилитров питательной среды MEM и тщательно ресуспендируйте клеточную суспензию. Перенесите клетки в новую 15-миллилитровую трубку, а затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте плотность клеточной суспензии до 60 000 клеток на миллилитр в МЕМ.

Далее добавьте 100 микролитров клеточной суспензии в контрольные и испытательные лунки стерильного, плоского дна, тканевой культуры обработанной 96 лункой планшета. Затем добавьте 100 микролитров питательной среды MEM в глухие лунки 96-луночного планшета. Инкубируйте 96-луночный планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.

Аспирируйте среду из лунок 96-луночной пластины. Во время аспирации среды избегайте отрыва и извлечения клеток из лунки. Этого можно достичь, используя низкую скорость аспирации и аккуратно размещая аспирационные наконечники в нижнем углу поверхности лунки.

Затем добавьте в тестовые лунки 25 микролитров двухкратных исследуемых соединений в МЭМ, включая трихостатин А, МС275 и тубастатин А. Добавьте 25 микролитров МЭМ в контрольную и глухую лунки. Далее добавьте 25 микролитров субстратной смеси в контрольную и тестовую лунки. Затем добавьте 25 микролитров MEM в глухие лунки.

Инкубируйте 96-луночный планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми часов в увлажнённом инкубаторе с содержанием углекислого газа 5%. Чтобы выполнить лизис клеток, сначала добавьте 10 микролитров шестикратного буфера RIPA с добавлением ингибитора протеазы в каждую лунку 96-луночного планшета. Остановите реакцию, добавив в каждую лунку по 160 микролитров холодного ацетонитрила, и перемешайте пипетированием вверх и вниз.

Поместите тарелку в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия на 10 минут. Достаньте тарелку из морозильной камеры и переложите по 220 микролитров содержимого каждой лунки на нестерильное коническое дно 96 луночной пластины. Центрифугируйте планшет при 5 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

После центрифугирования переведите 200 микролитров надосадочной жидкости в 96-луночный планшет, совместимый с системой УВЭЖХ. Затем запечатайте пластину отслаивающейся термосвариваемой пленкой с помощью запайщика для пластин. Подготовьте систему масс-спектрометрии для жидкостной хроматографии со сверхвысокими эксплуатационными характеристиками, заполнив ее подвижной фазовой системой.

Поместите планшет на 96 лунок в менеджер образцов, содержащий держатель для планшетов. Запустите образцы в соответствии с условиями UHPLC ESI MS/MS, приведенными в тексте. Для выполнения анализа данных интегрируйте пиковую площадь каждой подложки и ее деацетилированного продукта с соответствующим программным обеспечением для интеграции УВЭЖХ.

Для каждого субстрата рассчитайте отношение пиковой площади деацетилированного к ацетилированному на каждой хроматограмме. Включите тестовые и контрольные образцы. Наконец, рассчитайте процент ингибирования HDAC для каждого тестового образца в соответствии с уравнением в текстовом протоколе.

Хроматограмма образца методом УВЭЖХ-МС представлена здесь. Пики, соответствующие субстратам, добавленным в клетки, детектируются в соответствии с их массовыми переходами, как описано в таблице 1 письменного протокола. MOCPAC деацетилируется HDAC1 для обеспечения деацетилированного пика MOCPAC.

Аналогичным образом, BATCP деацетилируется HDAC6 для обеспечения деацетилированного пика BATCP. Наконец, MAL обеспечивает деацетилированный пик MAL, который неспецифически отражает деацетилирование нескольких эндогенных HDAC. На рисунке представлен рисунок с хроматограммой, полученной при различных концентрациях ингибитора HDAC трихостатина А.А. Оценка реакции на дозу стандартных ингибиторов HDAC.

Интегральные значения, полученные от MOCPAC и dMOCPAC, были использованы для расчета эффективности стандартных ингибиторов в отношении HDAC1. После расчетов IC 50 MS275, селективный ингибитор HDAC класса I, показал более низкие значения IC 50 для HDAC1, чем тубастатин А, известный ингибитор HDAC6. С другой стороны, изолированные значения из BATCP и dBATCP были использованы для расчета эффективности стандартов по отношению к HDAC6.

На этот раз тубастатин А обеспечил более низкое значение IC 50, чем MS275, что подтверждает их профиль селективности изоформы. Трихостатин А является мощным неселективным ингибитором. После освоения этой техники ее можно выполнить за 72 часа, если она выполнена правильно, включая время обработки клеток и анализ 96-луночного планшета.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что время инкубации, указанное здесь, относится к клеткам HeLa. Если используется другая клеточная линия, это необходимо оптимизировать. Следуя этой процедуре, можно измерить селективную ингибиторную активность HDAC других изоформ до тех пор, пока существуют специфические субстраты.

Не забывайте, что работа с органическими растворителями и другими химическими веществами может быть чрезвычайно опасной, поэтому во время выполнения этой процедуры всегда следует надевать защитные очки, перчатки и лабораторный халат.