Время-замедление конфокальной визуализации мигрирующих нейронов в органотипической культуре срезов мозга эмбриональной мыши с использованием

Общая цель данной процедуры заключается в прямом наблюдении радиально мигрирующих нейронов в органотипической культуре срезов, приготовленных из электропорированного эмбрионального мозга, с помощью конфокальной микроскопии в режиме таймлапс. Этот метод позволяет изучать ключевые аспекты развития неокортекса. Он дает возможность исследовать молекулярные механизмы, участвующие в поляризации нейронов и их радиальной миграции к конечному положению в головном мозге.

Основным преимуществом данного метода является возможность анализа динамических свойств мигрирующих нейронов, включая профили скорости, среднюю скорость миграции, а также изменения направления миграции. Начните с размещения надлежащим образом анестезированной беременной мыши в положении на спине на подогревательной платформе. Убедитесь в отсутствии педального рефлекса.

Затем осторожно смажьте глаза вазелином, чтобы предотвратить их пересыхание. После этого аккуратно расправьте конечности и зафиксируйте их на подогревном столике с помощью хирургического пластыря. Стерилизуйте область живота, протерев ее 70% ethanol, а затем раствором йода; после этого наложите на живот стерильную марлю с прорезью для выполнения абдоминального разреза.

Смочите марлю бактериостатическим раствором хлорида натрия. После повторной оценки развития хирургической анестезии по потере педального рефлекса, используя микропинцет Adson с зубцами и изогнутые тонкие ножницы, сделайте разрез кожи длиной примерно 1.5 сантиметров по срединной линии живота. Затем рассеките подлежащие мышцы по белой линии (linea alba).

Захватите рог матки между эмбрионами с помощью кольцевидного зажима и аккуратно поместите его на увлажненную марлю, не повреждая плаценты и питающие сосуды. Затем осторожно расположите эмбрион так, чтобы обеспечить четкий обзор бокового желудочка, который выглядит как серповидная тень, параллельная сагиттальному синусу. Место инъекции находится посередине линии между пигментированным глазом и слиянием синусов, где сагиттальный синус разветвляется на два поперечных синуса.

После идентификации проколите стенку матки иглой для микроинъекций и введите ее в боковой желудочек. Затем с помощью микроинъектора, управляемого ножной педалью, введите от 1 до 2 µL раствора ДНК, используя от 5 до 10 импульсов. Успешность инъекции можно контролировать по цветному раствору ДНК, который должен заполнить желудочковую систему.

Затем установите электрод-пинцет таким образом, чтобы положительный терминал находился с той же стороны, что и инъецированный желудочек, а отрицательный терминал — с противоположной стороны от инъецированного желудочка под ухом головы эмбриона. Увлажните место электропорации несколькими каплями бактериостатического раствора хлорида натрия и подайте пять импульсов электрического тока длительностью 50 ms с интервалами 950 ms. Появление пузырьков у отрицательного электрода указывает на прохождение электрического тока.

Для успешной электропорации обычно достаточно силы тока от 60 до 90 миллиампер. Более низкие значения тока не обеспечат эффективную трансфекцию нейронов, в то время как более высокие могут привести к гибели эмбрионов. После повторения процедуры для каждого эмбриона первого рога матки осторожно верните его в брюшную полость.

После наложения швов на мышечный слой и кожу осторожно продезинфицируйте область раствором йода и аккуратно удалите вазелин с глаз с помощью целлюлозных тампонов. Поместите мышь под инфракрасную лампу до ее пробуждения. После эвтаназии беременной самки утвержденным методом извлеките матку с эмбрионами и поместите ее в чашку Петри диаметром 10 см с ледяным полным HBSS.

С этого момента держите все растворы, эмбрионы и головной мозг на льду. Работая под стереомикроскопом, используйте тонкие пинцеты и пружинные ножницы Ваннаса Tubingen, чтобы отделить каждый эмбрион от матки. Перенесите эмбрионы в другую чашку Петри с ледяным полным раствором HBSS.

Сделайте разрез на уровне ствола мозга и разрежьте вдоль сагиттальной срединной линии. Отслоите кожу и хрящ, покрывающие мозг. Затем отсеките ствол мозга сразу за полушариями и извлеките мозг из черепа.

Перенесите мозг с помощью микроложечки-шпателя в 12-луночный планшет, содержащий ледяной complete HBSS. Соберите все образцы мозга из одного помета в 12-луночный планшет. Затем с помощью флуоресцентного стереомикроскопа осмотрите образцы мозга в планшете, чтобы оценить интенсивность флуоресценции, а также размер электропорированной области.

Выберите от двух до четырех образцов мозга с ярким флуоресцентным сигналом и предполагаемой соматосенсорной корой для дальнейшей обработки. Затем залейте расплавленный 3% раствор низкоплавящегося агарозы в одноразовую форму для заливки с отрывным бортом. С помощью микроложечки-шпателя извлеките мозг из 12-луночного планшета и осторожно удалите излишки complete HBSS вокруг мозга, используя тонкую фильтровальную бумагу.

Осторожно поместите мозг в раствор агарозы. Затем с помощью иглы 20-го калибра прижмите его ко дну формы и аккуратно отрегулируйте положение. Для получения корональных срезов ориентируйте мозг так, чтобы обонятельные луковицы были направлены вверх.

Держите форму на льду до затвердевания раствора агарозы, после чего переходите к секционированию мозга. С помощью чистого лезвия бритвы удалите излишки агарозы вокруг мозга, оставив примерно 1 мм агарозы со всех сторон, кроме области ольфакторных луковиц, где следует оставить от 2 до 3 мм агарозы. Нанеся небольшое количество цианоакрилатного клея на предметное стекло, зафиксируйте обрезанный блок агарозы так, чтобы ольфакторные луковицы были направлены вниз.

Перенесите предметный столик в камеру для срезания вибротома, содержащую ледяной полноценный раствор HBSS, и расположите мозг дорсальной стороной к ножу. Сделайте срезы мозга толщиной 250 micron, включающие электропорированный участок, используя низкую или умеренную амплитуду и очень низкую скорость срезания. Обычно из каждого успешно электропорированного мозга получают от четырех до шести срезов с ярким флуоресцентным сигналом.

Захватите агарозный край одного среза тонкоострым пинцетом и перенесите срез на изогнутую микроложечку-шпатель. Таким образом осторожно перенесите срезы мозга в шестилуночный планшет с ледяным полным раствором HBSS. Увлажните мембранные вставки, покрытые ламинином, 100 µL полного раствора HBSS.

Затем осторожно перенесите срезы на мембраны с помощью изогнутого микрошпателя-ложки и пинцета. Аккуратно переместите срез со шпателя на мембрану, после чего зафиксируйте его положение с помощью пинцета. Перенесите таким же образом остальные срезы.

На одну мембранную вставку можно поместить до пяти срезов. Удалите излишки полного HBSS с помощью пипетки. Затем, используя пинцет, аккуратно перенесите мембранные вставки со срезами в шестилуночный планшет, содержащий 1,8 миллилитра среды для культивирования срезов.

Выберите срез мозга для визуализации, просматривая срезы через инвертированный микроскоп. Выберите срез с ярко выраженными отдельными нейронами в верхней SVZ, которые радиально мигрируют к поверхности среза. Наличие тонких флуоресцентных отростков радиальных глиальных клеток, охватывающих всю пластинку, указывает на сохранность радиального глиального каркаса, который используется мигрирующими нейронами.

Перенесите мембранный вкладыш с выбранным срезом в стеклянную чашку с плоским дном диаметром 50 мм, содержащую 2 мл среды для культивирования срезов. Поместите чашку в климатическую камеру конфокального микроскопа. Установите разрешение 512 на 512 пикселей.

Увеличьте скорость сканирования с 400 hertz до 700 hertz, чтобы повысить частоту кадров примерно с 1,4 до 2,5 кадров в секунду. Используйте усреднение не более двух раз. Определите Z-стек через область электропорации с шагом 1.5 microns.

Начните серию таймлапс-съемки, выполняя Z-стек каждые 30 минут. Описанные настройки обеспечивают достаточное разрешение и яркость изображения, при этом сводя к минимуму фотоповреждение в процессе сбора данных. На данном видео показана миграция кортикальных нейронов E16.5 из вентрикулярной и субвентрикулярной зон в кортикальную пластинку.

У conditional-трансгенной линии Bcl11a floxed после электропорации контрольной плазмиды IRES-GFP на 14,5 эмбриональный день. Видео состоит из 108 кадров при частоте пять кадров в секунду. Масштабный отрезок соответствует 100 мкм.

Электропорация плазмидного вектора ДНК, содержащего Cre-IRES-GFP, повлияла на миграцию кортикальных нейронов в условном нокауте по гену Bcl11a (floxed brains). Как видно здесь, очень немногие нейроны перемещаются за пределы промежуточной зоны, чтобы достичь кортикальной пластинки. В этом видео показана поляризация кортикальных нейронов GFP-меченого контроля слева в сравнении с нейронами мутанта Bcl11a справа.

Эти анимированные треки репрезентативного контроля в нейронах с мутацией Bcl11a были получены из серий тайм-лапс снимков культур срезов E16.5 с интервалом в один час. Снова данные из контрольного мозга показаны слева, а данные из мозга после электропорации Cre-IRES-GFP — справа. Как видно из этого набора репрезентативных треков из контрольных культур срезов и культур срезов с мутацией Bcl11a, нейроны с мутацией Bcl11a часто проходят через повторяющиеся фазы снижения скорости миграции и случайного изменения ориентации, отмеченные красными стрелками.

Профили скорости могут быть рассчитаны на основе траекторий мигрирующих нейронов. Как видно здесь, большая доля нейронов с мутацией Bcl11a характеризуется более низкой скоростью миграции по сравнению с контрольной группой. Угол отклонения может быть рассчитан по данным траекторий.

Как видно из этой гистограммы, нейроны с мутацией Bcl11a, обозначенные черными столбцами, характеризуются бóльшими углами отклонения по сравнению с контролем. После освоения данной методики электропорация in utero, как и подготовка органотипических культур срезов мозга, занимает менее двух часов в каждом случае. Данную процедуру можно легко адаптировать для проведения фракционного анализа интересующих генов в радиально мигрирующих кортикальных нейронах с помощью усиления или подавления функции, а также для проведения сосудистых экспериментов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как с помощью конфокальной микроскопии с функцией тайм-лапс напрямую наблюдать за радиальной миграцией нейронов в органотипических культурах срезов, приготовленных из электропорированных эмбриональных головных мозгов.