Время-замедление конфокальной визуализации мигрирующих нейронов в органотипической культуре срезов мозга эмбриональной мыши с использованием В Утеро Электротовары

Этот протокол содержит инструкции по прямому наблюдению радиально мигрирующих кортикальных нейронов. При внутриутробной электропорации органотипическая культура срезов и временная конфокальная визуализация объединяются для непосредственного и динамического изучения эффектов избыточной экспрессии или снижения регуляции генов, представляющих интерес в мигрирующих нейронах, и анализа их дифференциации во время развития.

Общая цель этой процедуры заключается в непосредственном наблюдении за радиально мигрирующими нейронами в органотипической культуре срезов, полученной из электропорированного эмбрионального мозга с помощью покадровой конфокальной микроскопии. Этот метод может помочь в изучении ключевых аспектов развития неокортекса. Это позволяет исследовать молекулярные механизмы, участвующие в поляризации нейронов и радиальной миграции нейронов в их конечное положение в мозге.

Основным преимуществом этой методики является то, что можно анализировать динамические свойства мигрирующих нейронов, включая профили скоростей, среднюю скорость миграции, а также изменения направления миграции. Начните с того, что поместите беременную мышь, находящуюся под анестезией, в положение лежа на согревающей пластине. Проверьте на отсутствие педального рефлекса.

А затем, тщательно накройте глаза вазелином, чтобы они не пересохли. Далее аккуратно разложите конечности и зафиксируйте их к согревающей пластине хирургическим пластырем. Простерилизуйте брюшную полость, протерев там 70% этанол с последующим добавлением раствора йода, затем положите на живот стерильную марлю, в которой сделан разрез на брюшной полости.

Смочите марлю бактериостатическим раствором хлорида натрия. После повторной оценки развития хирургической анестезии, при потере педального рефлекса, с помощью зубчатых щипцов Micro Adson и наклонных мелких ножниц разрежьте кожу примерно на 1,5 сантиметра по средней линии живота. Затем разрежьте нижележащую мышцу по белой линии.

Захватите рог матки между эмбрионами кольцевыми щипцами и аккуратно поместите его на увлажненную марлю, не нарушая плаценты или питающие сосуды. Затем осторожно расположите эмбрион, чтобы обеспечить четкий вид на боковой желудочек, который представляет собой тень в форме полумесяца, параллельную сагиттальному синусу. Место инъекции находится посередине линии между пигментированным глазом и слиянием пазух, где сагиттальный синус разветвляется на две переходные пазухи.

После идентификации введите иглу для микроинъекций через стенку матки в боковой желудочек. Затем с помощью микроинъектора, управляемого ножной педалью, введите от одного до двух микролитров раствора ДНК с пятью-10 импульсами. Успешность инъекции может контролироваться с помощью цветного раствора ДНК, который должен заполнить желудочковую систему.

Затем поместите электроды типа пинцета таким образом, чтобы положительный конец находился на той же стороне, что и инъецируемый желудочек, а отрицательный конец — на противоположной стороне инъецируемого желудочка ниже уха головы эмбриона. Смочите место электропорации несколькими каплями бактериостатического раствора хлорида натрия и подайте пять импульсов электрического тока длительностью 50 миллисекунд с интервалом 950 миллисекунд. Пузырьки на отрицательном электроде указывают на электрический ток.

Обычно достаточно от 60 до 90 миллиампер для успешной электропорации. Более низкие токи не будут эффективно трансфицировать нейроны, в то время как более высокие токи могут привести к гибели эмбриона. Повторив процедуру для каждого эмбриона первого маточного рога, аккуратно поместите его обратно в брюшную полость.

После наложения швов на мышечный слой и кожу тщательно продезинфицируйте раствором йода и аккуратно удалите вазелин с глаз с помощью целлюлозных тампонов. Поместите мышь под инфракрасную лампу до тех пор, пока она не проснется. После усыпления беременной самки с помощью утвержденного метода удалите матку, содержащую эмбрионы, и поместите ее в 10-сантиметровую чашку Петри с ледяным полным HBSS.

С этого момента все растворы, эмбрионы и мозги должны быть заморожены. Работая под стереомикроскопом, используйте щипцы с тонкими наконечниками и пружинные ножницы Vannas Tubingen, чтобы отделить каждый эмбрион от матки. Перенесите эмбрионы в другую чашку Петри, содержащую ледяной полный HBSS.

Сделайте надрез на уровне ствола мозга и разрежьте по сагиттальной средней линии. Снимите кожу и хрящи, покрывающие мозг. Затем отрежьте ствол мозга прямо за полушариями и удалите мозг из черепа.

Перенесите мозг с помощью шпателя с микроложкой на 12-луночную пластину, содержащую ледяной полный HBSS. Соберите все мозги из подстилки в 12-луночную тарелку. Затем используйте флуоресцентный стереомикроскоп для скрининга мозга в 12-луночной пластине на яркость флуоресценции, а также размер электропорированной области.

Выберите от двух до четырех мозгов с яркими флуоресцентными сигналами и предполагаемую соматосенсорную кору для дальнейшей обработки. Затем вылейте расплавленный 3%-ный раствор агарозы с низкой температурой плавления в отслаивающуюся одноразовую форму для встраивания. Используйте шпатель для микроложки, чтобы извлечь мозг из 12-луночной пластины и осторожно слейте излишки полного HBSS вокруг мозга с помощью тонкой папиросной бумаги.

Аккуратно поместите мозг в раствор агарозы. Затем с помощью иглы 20-го калибра протолкните его на дно формы и осторожно отрегулируйте его положение. Для коронарных отделов ориентируйте мозг так, чтобы обонятельные луковицы были направлены вверх.

Держите форму на льду, пока раствор агарозы не застынет, затем приступайте к разрезанию мозга. Используйте чистое лезвие бритвы, чтобы обрезать излишки агарозы вокруг мозга, оставив примерно один миллиметр агарозы со всех сторон, за исключением обонятельных луковиц, где следует оставить два-три миллиметра агарозы. Нанеся на образец небольшое количество цианоакрилатного клея, зафиксируйте обрезанный агарозный блок обонятельными луковицами направлением вниз.

Перенесите стадию образца в камеру для срезки микротома вибрирующего лезвия, содержащего ледяной полный HBSS, и расположите мозг тыльной стороной к лезвию. Разрежьте срезы мозга толщиной 250 микрон, содержащие электропорированную область с низкой или умеренной амплитудой и очень медленной скоростью разрезания. Обычно от четырех до шести срезов с ярким флуоресцентным сигналом получают от каждого успешно электропорированного мозга.

Возьмитесь за агарозный ободок одного участка щипцами с тонким наконечником и натяните ломтик на согнутый шпатель микроложкой. Таким образом, осторожно перенесите срезы мозга в шестилуночную пластину, содержащую ледяной полный HBSS. Смочите мембранные вставки, покрытые ламинином, 100 микролитрами полного HBSS.

Затем аккуратно перенесите срезы на мембраны с помощью согнутой микроложки шпателя и щипцов. Аккуратно надавите на срез из шпателя на мембрану, затем расположите с помощью щипцов. Продолжайте перекладывать оставшиеся ломтики.

На одной мембранной вставке можно разместить до пяти срезов. Удалите излишки HBSS в сборе с помощью пипетки. Затем с помощью щипцов аккуратно поместить мембранные вставки со срезами в шестилуночную пластину, содержащую 1,8 миллилитра нарезанной питательной среды.

Выберите срез мозга для визуализации, рассматривая срезы через перевернутый микроскоп. Выберите срез с яркими одиночными нейронами в верхней части СВЗ, мигрирующими радиально к поверхности ворса среза. Наличие тонких флуоресцентных отростков радиальных глиальных клеток, которые охватывают всю конъюгатную пластинку, указывает на наличие интактного радиального глиального каркаса, который используется мигрирующими конъюгатными нейронами.

Переложите мембранный вкладыш с выбранным ломтиком в посуду со стеклянным дном диаметром 50 мм, содержащую два миллилитра питательной среды для срезов. Поместите чашку в климатическую камеру конфокального микроскопа. Установите разрешение 512 на 512 пикселей.

Увеличьте скорость сканирования с 400 Гц до 700 Гц, чтобы увеличить частоту кадров примерно с 1,4 до примерно 2,5 кадров в секунду. Используйте не более двух раз усреднения. Определите Z-стек через электропорированную область с шагом 1,5 мкм.

Запускайте серию интервальной съемки, снимая Z-стек каждые 30 минут. Описанные настройки позволяют обеспечить достаточное разрешение и яркость изображения, сохраняя при этом низкий уровень повреждения фотографий во время съемки. В этом фильме показаны нейроны коры головного мозга E16.5, мигрирующие из желудочковых субвентральных зон в корковую пластину.

В Bcl11a флоксированный условный трансген после электропорации контрольной плазмиды IRES-GFP на эмбриональные 14,5-е сутки. Фильм состоит из 108 кадров со скоростью пять кадров в секунду. Масштабная линейка представляет собой 100 микрон.

Электропорация плазмидного вектора ДНК, содержащего Cre-IRES-GFP, повлияла на миграцию корковых нейронов в головном мозге с условным Bcl11a. Как видно на рисунке, очень немногие нейроны проходят через промежуточную зону, чтобы достичь кортикальной пластинки. В этом фильме показана поляризация корковых нейронов из контрольной группы, меченной GFP, слева по сравнению с нейронами мутанта Bcl11a справа.

Эти анимированные следы репрезентативного контроля в мутантных нейронах Bcl11a были получены из покадровой серии культур срезов E16.5 с разрешением в один час. Опять же, данные от контрольного мозга показаны слева, а данные от электропорированного мозга Cre-IRES-GFP показаны справа. Как видно из этой коллекции репрезентативных следов из контрольных культур и культур мутантных срезов Bcl11a, мутантные нейроны Bcl11a часто претерпевают повторяющиеся фазы снижения скорости миграции и случайного изменения ориентации, как отмечено красными стрелками.

Профили скорости могут быть рассчитаны по следам мигрирующих нейронов. Как видно на рисунке, большая часть мутантных нейронов Bcl11a имеет более медленную скорость миграции по сравнению с контрольной группой. Угол отклонения может быть рассчитан на основе данных трассировки.

Как видно из этой гистограммы, мутантные нейроны Bcl11a, представленные черными полосами, демонстрируют большие углы отклонения по сравнению с контрольной группой. После освоения эта техника может быть выполнена менее чем за два часа для внутриутробной электропорации и подготовки органотипической культуры срезов мозга. Эта процедура может быть легко адаптирована для проведения фракционного анализа генов, представляющих интерес в радиально мигрирующих корковых нейронах по усилению и потере функции, а также для сосудистых экспериментов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как непосредственно наблюдать за радиально мигрирующими нейронами в органотипической культуре срезов, полученной из электропорированного эмбрионального мозга с помощью покадровой конфокальной микроскопии.