Определение и характеристика метастатическим факторов путем переноса генов в романе RIP-тег; РИП tva мышиных модель
16 октября 2017 г.
Мы представляем протокол продемонстрировать Роман соматическая генная система передачи, используя RIP-тегов; RIP-tva мыши модель для изучения функции генов в метастазов. Птичий ретровирусы поставляются intracardiacally обеспечить перенос генов в предварительно злокачественных, неинвазивный поражения поджелудочной железы β-клеток у взрослых мышей.
Общей целью этой процедуры является идентификация и характеристика метастатических факторов путем переноса генов в Novel RIP-Tag; Модель мыши RIP-tva. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазирования рака, такие как определение движущих сил и новых терапевтических мишеней. Основным преимуществом этой мышиной модели рака является идентификация метастатических факторов путем переноса соматических генов в легионы-предшественники бета-клеток поджелудочной железы.
Начните со сбора одной 15-сантиметровой чашки вирусных клеток DF1 на каждую инфицированную мышь. Сначала соберите среду из сливающейся 15-сантиметровой посуды. Затем удалите остатки клеток путем центрифугирования на низкой скорости в предварительно охлажденной центрифуге в течение 10 минут при температуре 1650 G и четырех градусах Цельсия.
Далее перенесите вирусную надосадочную жидкость в полиалломерные ультрацентрифужные пробирки. Вращайте в ультрацентрифуге в течение 1,5 часов при температуре 9540 раз G и четырех градусах Цельсия. Удалите как можно больше надосадочной жидкости из пробирок ультрацентрифуги.
Затем добавьте PBS в ультрацентрифужную пробирку, чтобы получилась конечная 100 микролитровая вирусная суспензия на 15-сантиметровую посуду. Накройте пробирки лабораторной пленкой и повторно суспендируйте невидимую вирусную гранулу путем вортексирования в течение двух минут на средней скорости. Затем раскачайте ультрацентрифужные пробирки при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа или на ночь.
После инкубации переложите вирусную суспензию в микроцентрифужную пробирку и приступайте к титрованию вируса. Начните процедуру титрования, убедившись, что клетки DF1, помещенные в 12-луночные тканевые культуральные планшеты, достигли конфлюенции 30%. Для определения титра вируса требуется один планшет с двенадцатью лунками.
Начните десятикратное серийное разведение вирусных надосадочных жидкостей, сначала смешав пять микролитров вирусной надосадочной жидкости с 495 микролитрами питательной среды в микроцентрифужной пробирке, чтобы получить десятикратное разведение во второй разведение. Кратковременно переведите вихрь на несколько секунд. Затем переведите 40 микролитров из десяти на второе разведение на 360 микролитров питательной среды в микроцентрифужную пробирку для десяти-третьего разведения.
Кратковременно переведите вихрь на несколько секунд. Продолжайте этот процесс разводить до десяти к четвертому и десяти к пятому. Далее внесите по 2,25 миллилитров питательной среды в каждую из пяти шестимиллилитровых полистирольных трубок.
И назовите их десятью к шестой, десять к седьмой, десять к восьмой, десять к девятой и десять к десятой соответственно. Смешайте 0,25 миллилитров десяти-пятого разведения с 2,25 миллилитров питательной среды в шестимиллилитровой полистирольной пробирке для десяти-шестого разведения. Кратковременно переведите вихрь на несколько секунд.
Повторите процедуру для десяти-седьмого, десяти — восьмого, десяти — девятого и десяти — десятого. Затем удалите исходную питательную среду из клеток DF1 на 12-луночных планшетах. И в каждую лунку в двух экземплярах добавить по одному миллилитру разведенного вируса.
Дайте клеткам расти при температуре 37 градусов Цельсия и 5 СО2 в течение как минимум семи дней. Начните процедуру заражения с обезболивания семинедельной мыши RIP-Tag RIP-tva. Нанесите глазную смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
Сбрейте волосы из грудной полости мыши RIP-Tag RIP-tva, положите мышь на спину грудью вверх на впитывающую лабораторную настольную бумагу поверх удобной безопасной грелки. Выполните щипнение пальцев ног, чтобы проверить животное на отсутствие реакции и подтвердить полный эффект анестезии. Вытяните передние конечности и закрепите их скотчем.
Отметьте грудную часть мыши для инъекции. Отметьте расположение на полпути между грудинной выемкой и верхней частью мечевидного отростка, а также немного слева анатомически от грудины. Затем потрите переднюю стенку грудной клетки либо скрабом с повидон-йодом, либо скрабом с хлоргексидином, а затем 70% изопропиловым спиртом или марлевой губкой, пропитанной на 70% этанолом.
Наберите 50 микролитров воздуха в стерильный инсулиновый шприц 28,5 калибра, чтобы создать пространство между поршенем и мениском шприца объемом 500 микролитров. Наберите 100 микролитров вируса. Воздушное пространство без жидкости на стене имеет решающее значение для определения сердечного пульса.
Держите иглу вертикально, держите кожу мыши натянутой одной рукой и введите иглу в отмеченное место. Когда в шприце появится ярко-красный пульс крови, прекратите продвижение иглы и зафиксируйте глубину залегания иглы в мышке одной рукой. Другой рукой осторожно и медленно нажимайте на поршень, чтобы доставить вирусную суспензию в течение примерно 60 секунд
.Подавайте 10-20 микролитров всякий раз, когда в шприце появляется ярко-красный пульс крови. Непрерывное поступление красной насыщенной кислородом крови в прозрачную ступицу иглы указывает на правильное положение иглы в левом желудочке. После последнего толчка грабителя доставить вирусную суспензию и до появления очередного красного пульса крови, быстро втянуть иглу из грудной полости.
Слегка надавите на место инъекции не менее чем на одну минуту, чтобы уменьшить кровотечение. Затем осторожно переместите мышь на грелку или под тепловую лампу до полного сознания. Мыши RIP-Tag RIP-tva были инфицированы указанным ретровирусом RCASBP-Bcl-xL в возрасте семи недель и усыплены в возрасте 16 недель.
На этой фотографии показано репрезентативное окрашивание синаптофизином метастатических нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы в лимфатических узлах поджелудочной железы. Здесь мыши RIP-Tag RIP-tva были инфицированы указанным RCASBP-RHAM B. На этой фотографии показано репрезентативное окрашивание синаптофизином метастатических нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы в лимфатических узлах поджелудочной железы. Здесь окрашивание синаптофизина наблюдается в печени после инъекции вируса RCASBP-RHAMM B.
Важно помнить, что для инфицирования in vivo пролиферирующих клеток TVA у мышей RIP-Tag RIP-tva требуется от десяти до восьми инфекционных единиц на миллилитр, а ретровирусный ректор RCASBP может доставлять CDNA до 2,5 килобаз. После разработки этой мышиной модели она проложила путь к изменению парадигмы, обнаружив, что BCL-xL на самом деле способствует метастазированию рака независимо от его антиапоптотической функции.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол новой системы соматического переноса генов с использованием мышиной модели RIP-Tag; RIP-tva для исследования функций генов при метастазировании. Метод предполагает внутрисердечное введение птичьих ретровирусов для воздействия на предраковые очаги β-клеток поджелудочной железы у взрослых мышей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Генная терапия
Теоретические основы
- Понимание механизмов метастазирования рака имеет решающее значение для разработки эффективных методов терапии.
- Мышиная модель RIP-Tag; RIP-tva позволяет осуществлять таргетный перенос генов.
- Птичьи ретровирусы могут быть использованы для эффективной доставки генов.
- Данный подход сфокусирован на очагах поражения предшественников β-клеток поджелудочной железы.
Цель исследования
- Идентификация и характеристика метастатических факторов с помощью переноса генов.
- Поиск потенциальных терапевтических мишеней для лечения рака.
- Углубление понимания механизмов, стимулирующих метастазирование.
Используемые методы
- Сбор клеток DF1 для продукции вируса.
- Сбор и центрифугирование среды для культивирования клеток.
- Внутрисердечное введение ретровирусов в целевые очаги поражения.
- Характеристика функции гена в метастатических процессах.
Основные результаты
- Успешный перенос генов в очаги поражения β-клеток поджелудочной железы.
- Идентификация ключевых факторов, участвующих в метастазировании.
- Потенциальные новые терапевтические мишени для лечения рака.
- Валидация модели RIP-Tag; RIP-tva для исследования рака.
Выводы
- В данном протоколе представлен эффективный метод изучения метастазирования.
- Полученные результаты могут способствовать развитию методов терапии рака.
- Модель RIP-Tag; RIP-tva является ценным инструментом для дальнейших исследований.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол обеспечивает систематическую идентификацию генов, стимулирующих метастазирование, на хорошо определенной модели нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, что позволяет восполнить критический пробел в доклинической валидации мишеней. Обеспечивая соматический перенос генов в предраковые поражения, этот метод способствует механистическому снижению рисков при выборе потенциальных терапевтических мишеней перед проведением дорогостоящих исследований in vivo. 100%-ная пенетрантность опухолей и определенные стадии прогрессирования в данной модели создают воспроизводимую платформу для оценки функции генов при метастазировании, что напрямую влияет на степень уверенности в выборе мишени и принятие решений по сортировке портфеля препаратов при разработке противоопухолевых средств в онкологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, определяя, способствуют ли конкретные гены развитию метастазов in vivo или подавляют его.
- Практическая ценность: использование соматического переноса генов позволяет обойти ограничения зародышевой линии, обеспечивая быстрое тестирование нескольких кандидатов на одном и том же генетическом фоне.
- Прогностическая ценность: позволяет выявлять факторы, способствующие метастазированию независимо от апоптоза, как показано на примере BCL-xL, раскрывая неканонические механизмы, которые могут быть упущены при стандартных анализах.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать метастатические и неметастатические изогенные клеточные линии на основе одной опухоли, что обеспечивает контролируемое сравнение функций генов при инвазии и колонизации.
- Практическая ценность: птичьи ретровирусные векторы обеспечивают высокоэффективное инфицирование клеток, экспрессирующих TVA, что способствует масштабируемому производству модифицированных клеточных линий для последующих анализов.
- Готовность анализа: вирусные титры >1x10^8 IU/mL гарантируют стабильное инфицирование in vivo, предоставляя количественный эталон для воспроизводимости экспериментов в различных исследованиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Характеризует метастатические факторы в модели, которая воспроизводит стадии человеческого туморогенеза от гиперплазии до инвазивной карциномы, что повышает трансляционную значимость.
- Практическая ценность: Позволяет осуществлять лонгитюдное отслеживание метастазирования в такие органы, как печень и лимфатические узлы, с помощью иммуногистохимии, обеспечивая гистопатологическую валидацию эффектов генов.
- Снижение рисков: Позволяет идентифицировать гены, стимулирующие метастазирование без необходимости формирования первичной опухоли, что позволяет сосредоточить ресурсы на истинных регуляторах метастазирования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от выдвижения гипотез о мишенях до доклинической валидации, в частности, обеспечивая функциональную валидацию генов, связанных с метастазированием, которые были выявлены в ходе омиксных исследований или скрининговых кампаний.
- Открывательная биология: обеспечивает проверку гипотез, позволяя проводить исследования усиления или потери функции в метастатических путях в рамках определенной модели опухоли.
- Скрининг: позволяет создавать стандартизированные генетически модифицированные клеточные линии, которые могут быть использованы в тестах на инвазию, миграцию или колонизацию для приоритизации результатов первичного скрининга.
- Аналитика: обеспечивает количественную оценку метастатической нагрузки по частоте возникновения опухолей в органах и гистопатологическому баллу, что позволяет проводить статистическое сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: связывают функцию гена с метастатическим прогрессированием в клинически значимом органе, что способствует подбору биомаркеров для последующей валидации.
- Корпоративное повторное использование: модель RIP-Tag;RIP-tva и ретровирусная система на основе DF1 могут быть использованы в нескольких проектах, что снижает затраты на повторную разработку исследований метастазирования.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: снижает механистическую неопределенность путем изоляции метастатической функции генов от их влияния на рост первичной опухоли или апоптоз.
- Практическая ценность: стандартизирует доставку генов посредством внутрисердечных инъекций с определенными вирусными титрами, что повышает воспроизводимость между лабораториями и снижает вариабельность в анализах метастазирования.
- Стратегическая ценность: предоставляет данные для принятия решений о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go), позволяя отличить истинные драйверы метастазирования от пассажирских мутаций, что предотвращает инвестиции в ложноположительные результаты.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе подтвержденной способности стимулировать или подавлять метастазирование, что повышает эффективность использования капитала в онкологических программах разработки.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических операций на мышах, работа с вирусами и соблюдение протоколов уровня биобезопасности 2 при использовании птичьего ретровируса.
- Необходимо оборудование для ультрацентрифугирования для концентрирования вируса и определения титра с помощью анализов по заражению клеток DF1.
- Требуется стандартизация титра вируса (>1x10^8 IU/mL) и объема инъекции (100 µL) во всех экспериментах для обеспечения стабильного воздействия на очаги поражения.
- Метод ограничен моделями, экспрессирующими TVA; адаптация к другим системам требует создания соответствующих рецептор-положительных линий.
- Оценка метастазирования основывается на конечной гистологии, что требует специализированной патоморфологической поддержки для обнаружения очагов поражения в таких органах, как печень и лимфатические узлы.
