Высок объём анализ двигательного поведения в Assay остров дрозофилы
5 ноября 2017 г.
Assay остров является относительно новой, экономически assay, который может использоваться для оценки основных двигательного поведения Drosophila melanogaster. Эта рукопись описаны алгоритмы для автоматической обработки данных и объективной количественной оценки остров анализа данных, что делает этот assay чувствительных, высок объём индикация для больших экранов генетических или фармакологических.
Общая цель метода «островного анализа» (Island Assay) заключается в оценке базового локомоторного поведения Drosophila melanogaster с помощью автоматической обработки данных и объективного количественного анализа. Данный метод может быть использован для идентификации ключевых регуляторов локомоторного поведения, например, генов, вовлеченных в развитие двигательных расстройств. Он также может применяться для тестирования препаратов, способных устранить такие дефекты.
Главным преимуществом данного метода является возможность высокопроизводительного количественного анализа локомоторного поведения Drosophila, что делает эту технику подходящей для проведения крупномасштабных скринингов. Мы решили разработать данную методологию, чтобы иметь возможность проанализировать большое количество моделей заболеваний. Для реализации этой задачи нам потребовался автоматизированный анализ данных изображений.
Визуальная демонстрация этого метода очень полезна. Несколько этапов обработки бета-данных являются критически важными и могут вызвать затруднения у новых пользователей, особенно у тех, кто не знаком с используемыми программными пакетами. Сначала подготовьте минимум три флакона для каждого экспериментального условия в качестве биологических повторностей.
Каждый файл должен содержать примерно 15 мух одного пола и схожего возраста. Важно, чтобы у мух были целые крылья. Создайте папки для хранения результатов экспериментов.
Создайте эти файлы в структуре каталогов, определенной условиями и повторами. Например, если в эксперименте участвуют два генотипа по пять повторов для каждого, создайте основную папку с датой эксперимента, а внутри этой папки — по одной подпапке для каждого генотипа. Затем в папках генотипов создайте подпапки для каждого повтора.
Затем подготовьте экспериментальную установку. Налейте в ванночку холодную воду с небольшим количеством мыла и поместите платформу в центр ванны, если она еще не закреплена. Накройте ванночку и платформу прозрачным коробом.
Для освещения платформы поместите над ней лампу с холодным светом, например, обычные 12-вольтовые светодиоды. Также установите веб-камеру, подключенную к компьютеру, непосредственно над платформой. На компьютере откройте программное обеспечение для записи изображений.
В системе меню выберите соответствующую веб-камеру в качестве устройства захвата. Поместите погибшую муху на предметный столик для настройки параметров видео. Отрегулируйте яркость, контрастность и цвет в программном обеспечении так, чтобы погибшая муха выглядела черной на белом фоне.
Затем настройте параметры записи таймлапс-видео так, чтобы файлы сохранялись в формате AVI. После этого перейдите в каталог, где должны быть сохранены данные, и укажите название видеофайла. Сохраните внесенные изменения.
Для сжатия данных изображения выберите кодек Intel IYUV. Установите скорость записи — один кадр каждые 0.1 seconds, и настройте соответствующую скорость воспроизведения на 10 images per second. Наконец, перейдите в расширенные настройки и выберите Create a bmp image for each captured frame.
Затем перейдите в ту же директорию, которую вы выбрали для размещения AVI-файлов, и нажмите «ОК». Перед началом работы убедитесь, что остров пуст и чист. После этого запустите запись в интерфейсе таймлапс-съемки программного обеспечения для регистрации изображений.
Возьмите пробирку с мухами и два или три раза постучите по ней, чтобы все особи переместились на дно. Затем быстро выньте пробку из пробирки и резкими движениями высыпьте мух на платформу. Все особи должны попасть на платформу примерно в одно и то же время.
Подождите до 30 секунд, пока мухи покинут платформу, затем остановите запись. При необходимости вручную удалите с платформы оставшихся мух. Перед переходом к следующему эксперименту обязательно заново определите директорию, в которой будет храниться следующий набор данных.
Первая задача — создать стеки и проекции из полученных серий изображений. В программе Fiji откройте Drosophila Island Assay. В появившемся окне введите идентификатор первой временной серии изображений.
Затем выберите только субмакрос для создания стека и проекции. Нажмите «ОК» и укажите компьютеру папку, содержащую все подпапки с отдельными экспериментами Island Assay. После обработки данных в каждой отдельной экспериментальной подпапке появятся два новых файла.
Следующий этап заключается в определении точного расположения платформы на изображениях. Откройте графический интерфейс и установите флажок «define platform». Затем выберите каталог, в котором хранятся подпапки с экспериментами.
Откроются изображение проекции и два окна. На первом изображении с помощью инструмента выделения многоугольником обведите островную платформу. Не включайте в данное выделение граничную линию по периметру платформы.
Добавьте выделенную область в окно менеджера ROI, нажав кнопку add в окне менеджера ROI. После добавления выделенной области в менеджер ROI она отобразится в виде набора значений. Затем нажмите okay в окне define the platform.
Программное обеспечение перейдет к следующему проекционному изображению, сохраненному в папке. Продолжайте применять ту же область интереса (ROI) для платформы к следующему проекционному изображению, выбрав сохраненную ROI в менеджере ROI и подтвердив эту ROI в окне определения платформы. Прежде чем переходить к следующему проекционному изображению, убедитесь, что платформа не сместилась во время эксперимента.
Если положение платформы сместилось, щелкните левой кнопкой мыши в центре выделения и перетащите его в нужное положение. Если рамка выделения не совпадает с платформой, щелкните левой кнопкой мыши вне области выделения и очертите новую область для платформы с помощью инструмента «Многоугольник» (polygon tool). Добавьте это новое выделение в менеджер ROI.
Затем подтвердите новый выбор, нажав «ОК» в окне определения платформы (define platform), и продолжайте процедуру до тех пор, пока для всех изображений не будут правильно определены платформы. Последним этапом перед обработкой данных является определение минимального размера мухи. Это подробно описано в текстовом протоколе.
Для количественного определения мух, покидающих платформу, сначала установите минимальный размер мухи. Затем укажите максимальное количество мух в одном файле в рамках серии экспериментов. Запустите функцию анализа и по запросу выберите основной каталог эксперимента.
После запуска макроса обратите внимание, что в каждой папке появились новый файл с результатами и новый стек изображений. Откройте эти файлы, чтобы убедиться в правильности выполнения процедуры. Запустите программный пакет R или RStudio и откройте скрипт анализа Island Assay для одновременной обработки всех экспериментов.
Для успешного проведения анализа необходимо правильно отредактировать скрипт. В строку 16 скрипта вставьте путь к основному каталогу, содержащему анализируемые эксперименты. В строку 19 вставьте путь к папке, в которой должны храниться выходные файлы анализа.
Последний должен быть расположен в папке, отличной от той, где находятся анализируемые данные изображений. Теперь запустите скрипт с панели инструментов и перейдите к анализу результатов. Скрипт Island Assay analysis экспортирует линейный график для каждого экспериментального условия.
На графике показан процент мух, оставшихся на платформе с течением времени для каждого повтора данного условия. Экспортированный линейный график «escape response:all conditions» обобщает среднее значение и стандартную ошибку среднего для реакции бегства в полете для первых 12 экспериментальных условий, представленных в основной папке. Для определения того, существенно ли различаются экспериментальные условия между собой, рассчитывается площадь под кривой для каждого экспериментального повтора.
Площадь под кривой и медианное значение для каждого экспериментального условия экспортируются в виде графика. В зависимости от количества условий в основной папке, скрипт выполнит либо двухсторонний независимый t-критерий Уэлча для двух условий, либо дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Тьюки для более чем двух условий. Все числовые данные, рассчитанные скриптом анализа Island Assay, также экспортируются и сохраняются в виде файлов csv или txt в папке вывода данных.
Атаксия-телеангиэктазия представляет собой аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся нарушением двигательных функций и вызванное мутациями в гене ATM. Заболевание проявляется ранним развитием мозжечковой атаксии. В ходе анализа Island Assay было изучено влияние повсеместного нокдауна ортолога гена ATM у дрозофилы в сравнении с контрольными группами.
В целом, повсеместный нокаут ортолога гена ATM у мухи, Tefu, значительно снизил локомоторную активность в тесте «Остров» (Island Assay) по сравнению с контрольной группой с тем же генетическим фоном. Ручной анализ данных, полученных в тесте «Остров», дал такие же результаты, как и автоматический анализ. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить тест «Остров», как запускать макрос для теста «Остров» у Drosophila и как использовать скрипт для анализа данных этого теста.
При выполнении данного протокола важно помнить, что качество сегментации изображения коррелирует с качеством видеозаписей. Чем выше контрастность, тем более точным будет анализ. После своей разработки эта методика открывает исследователям возможность высокопроизводительного изучения локомоторной способности Drosophila.
После проведения данного анализа можно использовать другие методы, например, тест на отрицательный геотаксис, для дальнейшего изучения дефектов локомоции.
Обзор
Островной тест (Island Assay) представляет собой новый метод оценки локомоторного поведения Drosophila melanogaster с использованием автоматизированной обработки данных. Данная методика позволяет проводить высокопроизводительный скрининг для генетических и фармакологических исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческий анализ
- Генетический скрининг
Теоретическое обоснование
- Метод «островного теста» (Island Assay) позволяет оценивать базовое локомоторное поведение плодовых мушек.
- Он помогает выявить ключевые регуляторы двигательных расстройств.
- Данный метод подходит для крупномасштабного скрининга моделей заболеваний.
- Автоматизированный анализ изображений повышает эффективность обработки данных.
Цель исследования
- Разработка высокопроизводительного метода анализа локомоторного поведения.
- Облегчение идентификации генетических факторов, влияющих на движение.
- Тестирование фармакологических препаратов, которые могут корректировать локомоторные нарушения.
Используемые методы
- Подготовка экспериментальных условий с биологическими повторностями.
- Настройка записывающей аппаратуры с соответствующим освещением и камерой.
- Автоматизированный захват и обработка изображений с использованием специализированного программного обеспечения.
- Количественная оценка поведения мух на основе определенных параметров.
Основные результаты
- Успешное внедрение метода островного теста (Island Assay) для анализа локомоции.
- Получение количественных данных для проведения масштабных генетических скринингов.
- Идентификация потенциальных препаратов-кандидатов для лечения двигательных расстройств.
- Разработка воспроизводимой методологии для будущих исследований.
Выводы
- Метод островного теста (Island Assay) обеспечивает надежную основу для изучения локомоторного поведения.
- Автоматизированная обработка повышает эффективность сбора данных.
- Данный метод подходит для высокопроизводительного генетического и фармакологического скрининга.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Метод Island Assay позволяет проводить высокопроизводительный автоматизированный количественный анализ локомоторного поведения Drosophila, устраняя критический барьер при валидации мишеней для терапии двигательных расстройств. Преобразуя ручной видеоанализ в объективные и воспроизводимые данные, данный метод обеспечивает масштабируемый скрининг генетических и фармакологических модуляторов локомоторной функции. Это делает данный анализ информативным с точки зрения механизмов и экономически эффективным инструментом для снижения рисков на ранних этапах программ по поиску новых терапевтических средств в неврологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки локомоторной реакции избегания как функционального показателя эффектов нокдауна генов или воздействия лекарственных препаратов.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет автоматизированного объективного измерения поведения мух при различных генетических условиях, что уменьшает влияние субъективного фактора при фенотипическом скрининге.
- Прогностическая ценность: позволяет рассчитывать показатели площади под кривой и медианную реакцию избегания, что упрощает сравнительный анализ и приоритизацию мишеней со значимыми локомоторными фенотипами.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные данные о локомоции с временным разрешением, что обеспечивает надежную оценку соединений при проведении крупномасштабного скрининга модификаторов двигательных расстройств.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимость анализа за счет автоматизированных конвейеров обработки изображений (Fiji и R), которые сводят к минимуму техническую вариабельность между повторностями и экспериментальными сериями.
- Масштабируемость: совместимость с высокопроизводительными рабочими процессами благодаря недорогому оборудованию (веб-камера, светодиодное освещение) и поддержке программного обеспечения с открытым исходным кодом, что способствует широкому внедрению в лабораторную практику.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет связать генетические модели Drosophila (например, нокдаун ортолога ATM) с механизмами двигательных расстройств у человека через консервативные локомоторные фенотипы.
- Механистическое снижение рисков: обеспечивает количественные показатели поведения, которые помогают отличить общие двигательные нарушения от специфических дефектов координации или выносливости, что повышает уверенность в выборе мишени.
- Доклиническое согласование: поддерживает анализ зависимости «доза-ответ» и временного хода действия фармакологических агентов, позволяя на ранних этапах оценить эффективность в системах, релевантных данному заболеванию.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод Island Assay встраивается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений, обеспечивая связь посредством поведенческого фенотипирования между генетическим скринингом и последующим изучением механизмов в рамках неврологических программ.
- Поисковая биология: способствует уточнению путей передачи сигнала и валидации мишеней путем связывания генетических пертурбаций (например, нокдауна ATM) с количественно определяемым локомоторным дефицитом, что позволяет проводить проверку гипотез в отношении мишеней.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет автоматического количественного определения времени побега мух с платформы, генерируя дозо- и времязависимые фенотипические показатели, подходящие для скрининга библиотек соединений.
- Аналитика: экспортирует значения площади под кривой и медианные значения с результатами статистического анализа (t-критерий Уэлча или ANOVA), что позволяет проводить сравнение между условиями и отбирать хиты в ходе скрининговых кампаний.
- Трансляционные исследования: согласуется с фенотипическим скринингом на моделях заболеваний, демонстрируя консервативные локомоторные дефекты в моделях атаксии человека на Drosophila, что подтверждает механистическую преемственность.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую стандартизированную платформу для оценки локомоторной функции, которую можно применять для различных мишеней, генотипов и скрининга соединений без необходимости повторной валидации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности путем объективной количественной оценки поведения с высоким разрешением.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет автоматизированной обработки данных, сводя к минимуму ручной труд и межоператорную вариабельность при проведении крупномасштабных скринингов.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя ранние количественные фенотипические данные, что снижает риск неудач на поздних стадиях разработки нейротерапевтических средств.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию мишеней и соединений с учетом рисков на основе статистически достоверных данных о локомоторном ответе, повышая эффективность распределения капитала в портфелях по поиску новых лекарственных средств.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с Fiji и R/RStudio для запуска макросов и проведения скриптового анализа, что предполагает наличие базовой подготовки в области биоинформатики или анализа изображений.
- Метод зависит от постоянства условий визуализации (освещение, контрастность, стабильность платформы) для обеспечения точной сегментации мух и надежной количественной оценки в разных экспериментах.
- Необходима стандартизированная подготовка мух (целостность крыльев, возраст, пол, плотность) для минимизации биологической вариабельности и обеспечения воспроизводимости анализа.
- Процесс включает этапы ручной настройки (определение ROI платформы, порог минимального размера мухи), которые должны строго соблюдаться для поддержания целостности данных между разными партиями образцов.
- Метод ограничен анализом поведения в 2D-плоскости; он не фиксирует вертикальный полет или сложные моторные последовательности, что требует использования дополнительных тестов для полного поведенческого профилирования.
