Исследования вирусов гриппа A в мышиной модели инфекции

Общая цель этой экспериментальной процедуры заключается в оценке патогенеза, гуморальных реакций и эффективности защиты, индуцированных вирусами дикого типа гриппа А или вакцинами против гриппа, с использованием мышиной модели инфекции. Этот метод может помочь ответить на вопросы о биологии вирусов гриппа А, такие как вирусный патогенез, иммунные реакции и эффективность вакцин против гриппа, а также антивирусных препаратов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мышь имеет иммунную систему, аналогичную человеческой, и существует множество штаммов, которые могут быть использованы для оценки генетической основы вирусной инфекции гриппа А.

Поскольку этот метод может дать представление об эффективности новых вакцин против гриппа, он также может быть применен к более старым системам, таким как оценка потенциальных противовирусных препаратов, включая антитела или лекарства. После выращивания и маркировки мышей C57B6 в возрасте от шести до восьми недель в условиях, свободных от патогенов, и приготовления разведения вируса гриппа А или IAV в асептических условиях. Используйте весы, чтобы взвесить мышей и записать вес.

После того, как мышь будет обезболена и глубина анестезии будет проверена в соответствии с текстовым протоколом, поместите мышь в лежачее положение на спине. Введите в ноздрю наконечник пипетки, содержащий 30 микролитров вирусного инокулюма и медленно, но постоянно выбрасывайте раствор. Для оценки заболеваемости и смертности необходимо инфицировать три-четыре группы самок мышей 10 полными дозами дикого типа PR8, как описано в текстовом протоколе.

Наблюдайте и взвешивайте мышей в течение следующих 14 дней, примерно в то же время, чтобы свести к минимуму колебания веса из-за приема пищи. После усыпления животных, переживших вирусную инфекцию, и расчета вирусной 50% мышиной летальной дозы или MLD50 согласно текстовому протоколу. Инфицируют самок мышей в возрасте от 6 до 8 недель вирусными дозами от 10 до 10 до четвертой флуоресцентных образующих единиц или FFU дикого типа PR8.

На второй и четвертый дни собрать легкие мышей и слизистую оболочку носа для оценки. После усыпления животных поместите животное в лежачее положение на спине и используйте 70% этанол для дезинфекции шерсти над грудной клеткой. С помощью ножниц разрежьте кожу от основания живота до грудины.

Затем ножницами сделайте разрезы в один сантиметр от основания разреза до боковых частей мыши. Снимите кожу со всей верхней части мыши до основания живота, где был сделан первый разрез. Затем с помощью ножниц отрежьте голову и поместите ее в сухую стерильную чашку Петри.

С помощью ножниц разрежьте места соединения между верхней и нижней челюстями и выбросьте нижнюю челюсть. Затем ножницами сделайте два надреза на концах скуловых дуг и удалите их. Используйте рассекающие щипцы для удаления глаз.

Далее с помощью щипцов для рассечения придерживайте черепную коробку и с помощью скальпеля разрежьте черепную коробку вдоль сагиттального шва. Поднимите две половины черепной коробки вместе с мозгом, чтобы увидеть слизистую оболочку носа. С помощью скальпеля разрежьте часть черепной коробки с мозгом и выбросьте ее.

Поместите оставшуюся часть черепной коробки со слизистой оболочкой носа в стерильную трубку. Храните пробирку на льду, если образцы обрабатываются в тот же день, или быстро замораживайте на сухом льду, если образцы будут обработаны позже. Чтобы избежать загрязнения образцов, используйте дезинфицирующее средство на основе диоксида хлора для очистки и дезинфекции инструментов для вскрытия между каждой восстановленной тканью и между каждым вскрытием животного.

Затем, чтобы собрать легкие, поместите животное в спинное лежачее положение и с помощью ножниц разрежьте плуру. Начиная с основания грудной клетки, с помощью ножниц разрежьте ребра по одному сантиметру с обеих сторон грудины до верхней части ребер. Сделайте ножницами поперечный разрез между двумя разрезами в верхней части грудной клетки и удалите место грудной клетки.

Придерживайте легкие щипцами, сделайте надрез на конце трахеи непосредственно перед легкими и поместите легкие в стерильную трубку. Поместите легкие или слизистую оболочку носа в стерильный гомогенизатор и добавьте один миллилитр среды для простудной инфекции. Гомогенизируйте образец, перемещая пестик вверх и вниз в течение примерно одной минуты при комнатной температуре, пока легкие не будут полностью разрушены.

Поместите гомогенизированный образец в стерильную пробирку. Центрифугируйте образцы при температуре 300 x G в течение 5-10 минут при комнатной температуре. Соберите надосадочную жидкость в новую стерильную пробирку и выбросьте гранулу.

Храните надосадочную жидкость при температуре четыре градуса Цельсия, если вирусное титрование проводится в тот же день. За день до титрования засейте в 96 луночных лунок эпителиальные клетки MDCK в среду для культивирования тканей так, чтобы они достигли примерно 80-90% конфлюенции. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение ночи.

Чтобы приготовить от одного до 10 разведений гомогенизированных образцов слизистой оболочки легких или носа, добавьте 90 микролитров инфекционной среды в каждую из лунок 96-луночного планшета. Добавьте 10 микролитров надосадочной жидкости из одного из гомогенизированных образцов в лунки А1, А2 и А3, чтобы оценить вирусный титул каждого образца и утроить. Затем добавьте в лунки по 10 микролитров другого надосадочной жидкости гомогенизированных образцов, А4, А5 и А6. После добавления надосадочной жидкости образца в ряд А с помощью многоканальной пипетки перемешивайте путем пипетирования вверх и вниз.

Переложите 10 микролитров из ряда А в ряд Б и хорошо перемешайте. Поменяйте кончики между разведениями и повторите перенос из ряда B в ряд C и продолжайте таким же образом, пока не дойдете до последнего ряда, H. Используя многоканальный адаптер вакуумного аспиратора, удалите питательную среду из клеток MDCK в 96-луночных планшетах и используйте 100 микролитров на лунку 1x PBS для двукратной промывки клеток. Начиная с более высоких разведений и переходя к более низким разведениям, перенесите 50 микролитров на лунку серийно разбавленной надосадочной жидкости гомогенизированных образцов на 96-луночный планшет клеток MDCK, перенося более высокие разведения из ряда H в ряд A клеток.

Поместите 96-луночную пластину на качающуюся платформу на один час при комнатной температуре, чтобы обеспечить всасывание вируса. Затем с помощью многоканального адаптера вакуумного аспиратора извлечь инокулянт и добавить 100 микролитров на лунку постинфекционной среды. Инкубируйте инфицированные клетки в течение восьми часов в инкубаторе с температурой 33 градуса Цельсия или 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Перейдите к исправлению, окрашиванию, визуализации и расчету вирусного заголовка, как описано в текстовом протоколе. В этом эксперименте мышей заражали разными дозами PR8 дикого типа. Масса тела и выживаемость пяти мышей в группе измерялись в течение 14 дней после заражения.

Мыши, иммунизированные более высоким FFU дикого типа PR8, быстрее и сильнее теряли вес, в результате чего все они погибли. MLD50 дикого типа PR8 в этом эксперименте, рассчитанный методом тростника и мюнха, составлял 1,5 х 10 ко второму ФОЕ. Для анализа гуморальных реакций, индуцированных на внутривенную инфекцию, через 14 дней после иммунизации мышам проводили обескровливание для анализа наличия антител против общего количества вирусных белков и наличия нейтрализующих антител, нацеленных на вирусный белок HA, с использованием ингибирования гемоагглютинации или HAI и микронейтрализации вируса или анализа VN.

Как видно из представленных здесь результатов, результаты анализа указывают на то, что сыворотки мышей, иммунизированных более высокой дозой живого аттенуированного вируса гриппа PR8 или LAIV, имели более высокие антитела к общим белкам PR8, чем сыворотки мышей, иммунизированных более низкой дозой. Используя анализы HAI и VN, сыворотки мышей с наибольшим количеством PR8 LAIV имели более высокий титул нейтрализующих антител, в то время как сыворотка от мышей, иммунизированных более низкой дозой, имела самый низкий титул нейтрализующих антител против PR8. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как заражать мышей вирусами гриппа А, как оценивать их патогенез, гуморальные и иммунные реакции и биорепликацию в верхних и нижних дыхательных путях.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области вируса гриппа А к изучению патогенности, иммуногенности и защитной эффективности вакцин на основе живых антител с использованием мышиной модели инфекции.