Выделение человеческих миобластов, оценка миогенной дифференциации и контроль потребления кальция в магазине

Общей целью этой процедуры является получение чистой популяции человеческих миобластов из скелетных мышц взрослого человека. Эти клетки используются для функциональных исследований, таких как оценка миогенной дифференцировки и измерение поступления кальция в хранилище. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет быстро, просто и воспроизводимо выделять первичные миобласты человека.

Эти миобласты являются новым ex-vivo для изучения передачи сигналов кальция во время регенерации мышц. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в мышечной области, такие как идентификация ионных каналов и факторов транскрипции, участвующих в дифференцировке мышц. Поскольку этот метод может дать представление о функциях генов во время миогенной дифференцировки человека.

Он также может быть применен к другим исследованиям, таким как потенциал использования миогенных стволовых клеток для лечения мышечных дистрофий. Переложите мышечный образец в стерильную шестисантиметровую пластину, промойте образец PBS дважды. Удалите остатки жировой ткани и взвесьте образец.

Далее добавьте трипсин и измельчите мышцу на кусочки размером менее двух миллиметров. После измельчения с помощью пипетки объемом 10 миллилитров переложите салфетку в 200-миллилитровую бутылку для диссоциации, содержащую мешалку, затем продолжайте собирать измельченную салфетку в растворе трипсина, пока бутылка для диссоциации не заполнится до 90 миллилитров. Теперь инкубируйте ткань на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут при легком помешивании.

Через час добавьте 10 миллилитров FCS, чтобы остановить реакцию и гомогенизировать смесь с помощью растирания. Теперь загрузите 70-микронные фильтры в две 50-миллилитровые пробирки и пропустите половину клеточной суспензии через каждый фильтр, пипетируя суспензию в фильтры. Далее сделайте суспензию клеток в питательную среду и наложите 200 000 клеток на шестисантиметровые пластины с четырьмя миллилитрами среды.

Инкубируйте тарелки, меняя среду каждые три дня. Через пять-семь дней клетки должны слиться на 70-80%, затем окрасьте их. Для начала промойте пластину от сливающихся клеток PBS.

Затем добавьте один миллилитр раствора трипсина и дайте ферменту подействовать в течение трех минут. Остановите реакцию, добавив два миллилитра среды, и соберите клетки в пробирку объемом 15 миллилитров. Затем раскрутите клетки вниз и снова суспензируйте их в одном миллилитре среды.

Затем проведите подсчет клеток, храня их на льду. Для анализа фактов загрузите семь трубок по 100 000 ячеек каждая. Загрузите оставшиеся ячейки в восьмую пробирку для сортировки.

Промойте клетки одним миллилитром холодного факсимильного буфера, затем центрифугируйте пробирки, аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте обратно 200 микролитров факс-буфера с соответствующими антителами и дайте клеткам инкубироваться на льду в течение 30 минут. Через 30 минут снова промойте клетки и повторно суспендируйте их в 500 микролитрах факс-буфера, затем отсортируйте клетки с помощью проточного цитометра.

После исключения CD45-положительных кроветворных клеток отделите CD45-отрицательные клетки на основе экспрессии CD56. Затем зарегистрируйте CD56-положительную популяцию для CD34, CD144 и CD146. Повторно проанализируйте часть отсортированной популяции, чтобы проверить чистоту.

Теперь вытащите человеческие миобласты и промойте их пятью миллилитрами среды. Затем повторно суспендируйте их в одном миллилитре среды. Переложите суспензию на шестисантиметровую пластину с четырьмя миллилитрами среды и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия с 7% углекислым газом.

Для этой процедуры следует провести культивирование миобластов и внести свежую трансвекционную среду. Инкубируйте среду при комнатной температуре от 15 до 20 минут. Во время инкубации среды подготавливают миобласты.

Сначала промойте их один раз с помощью PBS. Затем трипсинизируйте адгезивные клетки. Остановите реакцию, добавив два миллилитра среды.

Затем соберите клетки в 50-миллилитровую пробирку. Закрутите их вниз и снова суспендируйте в одном миллилитре среды. Для каждой трансвекции готовят 500 000 клеток в 200 микролитрах среды.

К каждым 500 микролитрам трансвекционной среды добавьте 200 микролитров аликвоты клеток, а затем перемешайте, используя всего два удара пистолета-дозатора. Затем дайте реакции протекать в течение пяти минут при комнатной температуре. Через пять минут переложите реакции в 3,5-сантиметровые чашки для культуры, каждая из которых содержит по одному стекло покровного стекла.

Далее добавьте 1,3 миллилитра среды для получения итогового объема в два миллилитра и инкубируйте посуду. После 48 часов дифференцировки клетки могут быть иммуноокрашены или проанализированы с помощью визуализации кальция. В любом из этих вариантов сначала тщательно промойте клетки дважды, используя для промывки один миллилитр PBS комнатной температуры.

Старайтесь не отсоединять миотрубки. Для визуализации кальция покройте промытые клетки двумя микромолярами fura-2 AM плюс один микромоляр треоновой кислотой в кальцийсодержащей среде. Затем дайте им поинкубироваться около 30 минут, прежде чем смешивать.

Затем дважды промойте клетки немодифицированной средой, содержащей кальций, а затем инкубируйте их в течение 10-15 минут для этерификации. Теперь снимите крышку с культуральной пластины и установите ее в экспериментальную камеру. Загрузите камеру кальцийсодержащей средой, поместите ее под микроскоп, затем начните запись данных.

Фура-2 возбуждается попеременно на 340 и 380 нанометрах. Излучение света собирается на 510 нанометрах. Погружение изображений с точностью 340 нанометров по 380 изображениям позволяет получить соотношения изображений, поскольку колебания и концентрация кальция относительно низкие, приобретают один коэффициент изображения каждые две секунды.

Через две-три минуты замените среду на среду без кальция. Затем в течение одной-двух минут наблюдайте за активностью накопленного кальция в клетках. Затем добавьте в клетки один микромоляр тапсигаргин, чтобы истощить их внутренние запасы кальция.

Подождите от восьми до 10 минут, затем быстро замените среду на среду, содержащую кальций, и в течение пяти минут зарегистрируйте, пока кальций поступает в клетки через вспомогательные каналы. После завершения эксперимента проанализируйте изображения. Выберите область, в которой нет клеток для первой области, которая определяет фон, затем выберите область в цитоплазме для второй области.

Эти две области могут быть нарисованы на любом из изображений в серии. Далее перейдите на вкладку запуска экспериментов и выберите референсные изображения для каналов 340 и 380, выберите первый регион, затем нажмите на вычесть фон. Теперь проведите весь эксперимент, чтобы удалить фон со всех изображений.

После завершения нажмите опцию «Регистрировать данные», чтобы открыть электронную таблицу, в которой записываются данные о времени и соотношении. Мышечные клетки были выращены, расширены и отсортированы с помощью факса. Миобласты составили более 60% анализируемой популяции.

Затем первичные человеческие миобласты культивировали в среде для дифференцировки и иммуноокрашивали на транскрипционный фактор белков тяжелой цепи MEF2 и миозина. Большинство клеток экспрессировали тяжелую цепь миозина и образовывали миотрубки со значениями индекса слияния около 60%, остальные 40% клеток оставались недифференцированными одноядерными клетками, также известными как резервные клетки. Описанный эксперимент по вводу кальция в магазин был успешно проведен на дифференцированных клетках.

Проведение того же эксперимента на клетках, трансвекцированных малыми интерферирующими РНК, направленными против проницаемых для кальция каналов семейства TRPC, показывает, что нокдаун оказал заметное влияние на поступление кальция в хранилище. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить миобласты человека из скелетных мышц взрослого человека. Мы используем эти клетки для изучения последовательных этапов мышечной дифференцировки и, в частности, дезактивации транскрипционных факторов и кальциевых каналов.

После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за три часа, если она выполнена правильно. Это быстрый, простой, воспроизводимый метод, который позволяет получить урожай человеческих миобластов. При попытке проведения этой процедуры важно не допустить полного доверия к культурам миобластов, так как произойдет нежелательная спонтанная дифференцировка.