Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

Общей целью этой процедуры является изучение фосфорилирования тау-белка, связывающих микротрубочки тау-белка и локализации тау-белка с помощью конфокальной микроскопии в клетках колоректального рака. Этот метод может быть эффективным для большинства областей биологических исследований, особенно для исследований рака и деменции, где фосфорилирование и связывание микротрубочек являются важными факторами. Основное преимущество представленного фосфоратазного анализа заключается в том, что он обеспечивает простой способ восприятия всего фосфорилирования образцов белка.

Основное преимущество анализа связывания микротрубочек заключается в том, что это простая процедура для отделения белков, связывающих микротрубочки, от несвязывающихся фракций. Тем не менее, основное преимущество метода локализации тау заключается в том, что он требует относительно небольшого количества первичных и вторичных антител. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте все реактивы так, как указано в текстовом протоколе.

Перенесите около одного миллиона клеток HCT 116 в культуральные чашки, содержащие минимально необходимую среду с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина стрептомицина. Когда клетки достигнут 65% конфлюенции, используйте аспиратор для удаления среды, дополненной FBS. Затем добавьте МЭМ, не содержащий сыворотки, содержащий либо куркумин, либо хлорид лития.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, в течение 24 часов. После этого промойте клетки 10 миллилитрами ледяного холодного PBS. Добавьте один миллилитр ледяного PBS, а затем с помощью скребка для клеток соскребите клетки и перенесите их в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Центрифугируйте в течение четырех минут при температуре 1800 G и четырех градусах Цельсия. Мы суспендируем клеточные гранулы в 100 микролитрах полного буфера RIPA при температуре четыре градуса Цельсия на 20 минут, регулярно постукивая по трубкам для лизирования клеток. Затем кратковременно обработайте образцы ультразвуком с амплитудой 10%, пульсируя в течение 0,2 секунды и выключив на 0,2 секунды, в общей сложности 2 секунды.

Центрифугируйте гомогенат клетки при температуре 22, 570 раз по G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Перенесите надосадочную жидкость в новые помеченные пробирки, а затем измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда, как указано в текстовом протоколе. После подготовки образцов, содержащих 20 мкг общего белка, добавьте в каждый по два микролитра буфера щелочной фосфатазы и по 10 микролитров щелочной фосфатазы.

Затем добавьте дистиллированную воду, так, чтобы конечный объем каждого образца составил 20 микролитров. Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Пока образцы инкубируются, готовят дополнительные образцы в той же концентрации, но без фосфатазы для сравнения.

Через час остановите реакцию, добавив либо ЭДТА в конечной концентрации 50 мкмольяр, либо ортованадат натрия в конечную концентрацию 10 мкмоль. Добавьте свежеприготовленный гелевый загрузочный буфер 4XSDS, содержащий 400 миллимолярных DTT. С помощью теплового блока инкубируйте образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Сделайте образцы вихревыми, а затем дайте им остыть при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Затем загрузите 13 микролитров образца в лунку, а также молекулярную взвешенную лестницу на 10% полиакриламидный гель. Подключите систему электрофореза к источнику питания и установите напряжение на 70 вольт на 20 минут, чтобы переместить образцы белка из укладывающего геля в разрешающий гель.

После этого увеличьте напряжение до 125 вольт и запустите гель в течение примерно 70-120 минут, пока образцы и белковая лестница не достигнут конца геля. С помощью системы влажного электроблоттинга перенесите гель на мембрану из поливинилиденфторида при напряжении 100 вольт примерно на 100 минут. Далее инкубируйте мембрану для промокания в 4%-ном бычьем сывороточном альбумине в течение 90 минут при комнатной температуре.

Инкубируйте блот в течение ночи в первичном растворе антител при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день промойте кляксу трижды в ПБСТ, каждый раз промывая по семь минут. Инкубируйте в неуверенном растворе вторичных антител в течение 90 минут при комнатной температуре.

Затем постирайте PBST четыре раза, каждая стирка длится семь минут. Проявите блот, используя набор для хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя. Накройте проявленный блот прозрачной полиэтиленовой пленкой, а затем получите хемилюминесцентные изображения блота с помощью коммерчески доступной системы хемилюминесцентной визуализации.

После подготовки свежих образцов инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Ультрацентрифугируйте образцы при температуре 100, 000 G и 25 градусах Цельсия в течение 60 минут. Затем переведите по 120 микролитров каждой надосадочной жидкости, содержащей несвязанный тау, в отдельные, чистые и помеченные пробирки.

Добавьте 120 микролитров буфера Fibic для образца в гранулу, содержащую связанный тау. После тщательного перемешивания с помощью вортекса и пипетирования переложите смесь в чистые пробирки с маркировкой. После подготовки образцов эквивалентной концентрации белка добавьте свежий гелевый буфер 4XSDS, содержащий 400 миллимолярных DTT.

Используйте тепловой блок для инкубации образцов при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут. Сделайте образцы вихревыми, а затем дайте им остыть при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Загрузите 13 микролитров образца в лунку и лестницу молекулярных масс в 10% полиакриламидный гель.

Подключите положительный и отрицательный электроды системы электрофореза к источнику питания, а затем установите напряжение на 70 вольт на 20 минут. После этого увеличьте напряжение до 125 вольт и запустите гель в течение примерно 70-120 минут, пока образцы и белковая лестница не достигнут конца геля. Используйте систему влажного электроблоттинга для переноса геля на мембрану из поливинилиденфторида при напряжении 100 вольт в течение примерно 100 минут.

Инкубируйте мембрану до промокания в 4%-ном бычьем сывороточном альбумине в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте в течение ночи в первичном растворе антител при четырех градусах Цельсия. На следующий день промойте кляксу четыре раза PBST, при этом каждое мытье длится семь минут.

Промытый блот инкубировать в соответствующем растворе вторичных антител в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем мойте PBST в течение семи минут, повторяя стирку в общей сложности четыре раза. Проявите блоттинг с помощью набора для хемилюминесценции.

Накройте прозрачной полиэтиленовой пленкой и получите изображения с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Для начала поместите покровные стекла в лунки шестилуночной тканевой покровной пластины, а затем засейте 250 000 клеток в каждую лунку в рекомендованной питательной среде. Через 24 часа дважды промойте клетки PBS.

Добавьте МЭМ без сыворотки, содержащий куркумин, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, в течение 24 часов. После этого снова промойте клетки ледяным ПБС. Закрепите клетки в 3,7% формальдегиде в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, в темноте.

Промойте клетки PBS, а затем закрепите клетки в ледяном метаноле при температуре 20 градусов Цельсия на 15 минут. После этого инкубируйте клетки на льду в 3% БСА и 0,1% Триконекс 100 в PBS в течение 10 минут. Промойте клетки PBS, а затем инкубируйте в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре.

Далее добавьте по 60 микролитров раствора первичного антитела в разрезанный в каждой лунке кусочек поливинилиденфторида. Размещение крышки скользит таким образом, чтобы клетки контактировали с раствором антитела. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия в темной влажной камере.

На следующий день четыре раза промойте камеры PBS. Добавьте 80 микролитров вторичного раствора антитела к каждому из кусочков поливинилиденфторида, расположив покровные стекла таким образом, чтобы клетки контактировали с раствором антитела. Выдерживать в темной влажной камере при комнатной температуре в течение двух часов.

После этого четыре раза промойте клетки PBS. Смонтируйте образцы в монтажный носитель с помощью DAPI, а затем закрепите защитные стекла на предметных стеклах. Затем выдерживают в темной камере при комнатной температуре в течение полутора часов.

С помощью конфокального микроскопа изучают предметные стекла. В этом исследовании специфическое фосфорилирование тау-белка оценивается с помощью фосфо-тау-антитела. Наблюдается, что клетки, обработанные куркумином, экспрессируют уменьшенное количество тау-белка по мере увеличения концентрации куркумина.

С другой стороны, наблюдается увеличение экспрессии фосфо-тау при более низких концентрациях куркумина, уменьшаясь только при очень высоких концентрациях. Затем исследуются клетки, обработанные хлоридом лития. Как видно, экспрессия как тау, так и фосфо-тау значительно снижается при обработке хлоридом лития.

Затем общее фосфорилирование оценивается с помощью анализа фосфотазы. Тау мигрирует быстрее в образцах, обработанных фосфотазой, по сравнению с необработанным контрольным образцом, что указывает на то, что контрольный образец фосфорилирован. Образцы клеток, обработанные куркумином, показали очень похожие результаты, что указывает на то, что лечение клеточных линий колоректального рака не уменьшало фосфорилирование тау.

Как обработанные, так и необработанные образцы электрофорировали почти в одинаковом диапазоне в образцах клеток, обработанных хлоридом лития, что указывает на снижение фосфорилирования тау. Затем успешно проводится анализ связывания микротрубчатых клеток с использованием тау-352 в качестве положительного контроля. Как показано здесь, как куркумин, так и обработка хлорида лития в низкой концентрации приводят к ингибированию связывающей активности микротрубочек.

Затем проводится конфокальная микроскопия. После лечения куркумином видно, что тау перемещается в ядро. Это подтверждает более ранние исследования, в которых сообщалось, что ядерный тау является ключевым игроком в защите нейронной ДНК.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить анализ фосфотазы для определения полного фосфорилирования образцов белка и как проводить анализ связывания микротрубочек. Вы должны быть в состоянии понять, как выполнить иммунофлуоресцентный анализ с помощью конфокальной микроскопии с использованием различных антител меньшего количества. Представленные здесь процедуры являются экономически эффективными и потенциально помогут в открытии и разработке новых терапевтических агентов для лечения различных видов тау-фореза и рака.