Name: Caenorhabditis elegans Анализ на основе меди на основе питательных веществ (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Изучите анализ медной аверсии Caenorhabditis elegans на основе питательного статуса для поведенческой нейробиологии. Этот метод позволяет оценивать изменения поведения червей при голодании в течение четырёх часов.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана Советом исследований естественных наук и инженерных исследований Канады Discovery Grant RGPIN36481-08 Уильяму Г. Бендене.

1. Подготовка экспериментальных организмов <ol><li> Выбирайте 10 L4-ступенчатых нематод на один штамм за 24 часа до начала анализа, чтобы убедиться, что организмы являются молодыми взрослыми при тестировании. Для каждого тестируемого мутанта или контрольной нематоды выберите 10 L4s (10 для контроля и 10 для анализа). <ol><li> Поддерживайте организмы L4 с использованием стандартных методов 26 , 27 в течение 24 часов на стандартных агаровых чашках, засеянных OP50 Escherichia coli . Если организмы теряются во время последующих этапов промывки, компенсируйте, увеличив размер исходного образца ( т. Е. Выберите 20 червей, а не 10). Примечание. Поведение - это врожденно изменяющийся фенотип. Выполните метод в трех экземплярах для каждого штамма в течение трех отдельных дней. Включите дополнительные контрольные штаммы и условия для новых штаммов, как указано в разделе обсуждения. </li></ol></li><li> Непосредственно перед анализом переносите экспериментальную оргуНигде на пластину агара без бактерий и позволяют нематодам свободно перемещаться в течение 1 мин для удаления лишних бактерий. <ol><li> Если экспериментальные организмы испытывали загрязнения в течение 24 ч до анализа, отбросьте их. </li></ol></li><li> Пипетируйте 1 мл M9 на бесконтактную пластину для мытья червей в микроцентрифужную пробирку. </li><li> Центрифуга при 3000 мкг в течение 1 мин. Черви должны образовывать гранулу в нижней части трубки. Аспирируйте раствор M9 без разрушения гранулы червя. Добавьте 1 мл M9 в гранулу червя, инвертирующую трубку для смешивания червей с раствором. </li><li> Повторите шаги 1.4 еще три раза. <ol><li> Если избыточные бактерии были первоначально перенесены с червями, повторите их в общей сложности 5 раз. Никакие бактерии не должны переноситься на плиты с медными блюдами. Если пища передается на пластину для анализа, она будет мешать точному сбору данных. </li></ol></li><li> После окончательной промывки отсасывают супернатант до 10081; L M9 и червячный осадок. Осторожно: поведение, связанное с голоданием, становится очевидным через 30 мин. Следовательно, черви должны быть немедленно перенесены из раствора после завершения промывки. </li></ol> 2. Получение аналитических пластин <ol><li> Подготовьте стандартные планшеты для агара NGM за два дня до анализа. <ol><li> Если пластины хранятся во влажной среде, сделайте агаровые пластины за 3 дня до анализа. В качестве альтернативы, снимите крышку пластины в течение 3 - 6 часов, чтобы обеспечить надлежащую сухость (если она находится в стерильной среде). </li></ol></li><li> С толстым постоянным маркером сделайте линию на нижней стороне пластины вдоль внешней кромки, а другую, чтобы сформировать барьер средней линии ( рис. 1 ). Барьер средней линии должен быть равноудален от каждого края пластины. Используйте линейку для обеспечения точных измерений. Эти линии будут служить руководством при переносе бактерий и раствора меди. При условии, чтоE. coli переносится до решения меди, эти линии будут служить индикаторами. </li><li> Посевная пластина с 50 мкл OP50 E. coli только на одной стороне медного барьера для создания однородного лужайки ( рис. 2 ). Концентрация бактерий должна оставаться постоянной в анализах; Однако незначительная изменчивость наблюдалась в ответ на умеренные различия в концентрации. <ol><li> Используйте отмеченные линии на нижней стороне пластины, чтобы бактерии не вступали в контакт с раствором меди. При условии, что медный раствор выстилает край плиты и образует барьер средней линии, переносите бактерии так, чтобы раствор меди не вступал в контакт с источником пищи. </li></ol></li><li> Отметьте второй набор пластин и не передайте им OP50 E. coli ( рисунок 2 ). Эти пластины будут служить для оценки отрицательного контроля. Эти пластины также должны иметьМаркировка на одной половине пластины для обозначения исходного происхождения переноса. </li><li> Позвольте бактериям высохнуть, затем инкубируйте планшеты при 37 ° C в течение ночи. Убедитесь, что бактериальные пятна не нарушены при переносе в инкубатор или помещение на 37 ° C. Чрезмерное нарушение может изменить местоположение или форму патча для пищи. </li></ol> 3. Анализ хемотаксиса <ol><li> Свежеприготовить 0,5 М раствор сульфата меди (II) до начала начала анализа. При условии, что 125 мкл раствора используют на пластину, увеличьте этот объем в зависимости от количества используемых аналитических пластин ( например, 5 аналитических пластин, 625 мкл). </li><li> Пипеткой 100 мкл раствора сульфата меди (II) на краю агара для создания наружного медного барьера. В качестве ориентира должна выступать маркированная нижняя сторона пластины. </li><li> Пипеткой 25 мкл раствора сульфата меди (II) для создания барьера средней линии. <ol><li> Убедитесь, что раствор сульфата меди (II)Не вступают в контакт с бактериальным пятном. Используйте пятнистую технику, поскольку полоскание может повлиять на локомоцию из-за углублений / царапин на агаре. </li></ol></li><li> Дайте раствору меди высохнуть на пластину. Период времени может варьироваться в зависимости от состояния пластин и лабораторных условий. Визуально проверяйте сухость каждые 5 минут после передачи. Примечание. Решение меди отображает синий оттенок и легко идентифицируется. Используйте лабораторную ткань, чтобы слегка прикрыть раствор вблизи края пластины, чтобы определить сухость. </li><li> Внесите 20 мкл гранулы червя из нижней части трубки на свободную от бактерий половину аналитической пластины. <ol><li> Убедитесь, что 10 червей переданы на тест-планшет. Если дополнительные черви были случайно включены, удалите их, взяв галоидоуглеводородное масло, чтобы не допустить добавления бактерий к тарелке. Каждый анализ должен иметь постоянное количество нематод во время анализа. ПРИМЕЧАНИЕ. Если слишком мало червей транслируютсяВо время анализа, увеличение первоначального размера выборки уменьшит потенциальные потери во время промывок и переноса. </li></ol></li><li> Удалите избыток M9 с пластины с помощью лабораторной ткани. M9 не должен контактировать с раствором сульфата меди (II). Предостережение: убедитесь, что червяки и поверхность агара остаются без изменений во время выполнения этого шага. Если использовать слишком жестко, лабораторная ткань может создавать углубления на поверхности агара пластины и может удалять черви. Черви, случайно удаленные с помощью KimWipe, должны быть отброшены. </li><li> Как только решение M9 было удалено, и все черви начали нежидкостные локомоторные узоры, запустите секундомер анализа. <ol><li> Оптимально удалите решение M9 в течение мин. Существенным параметром является идентификация синусоидальной локомоции. Черви локомотируют по-разному, например, измельчают, а не синусоидально, когда в жидкости. Начните секундомер после каждого экспериментального органаИзмы перестают биться. </li></ol></li><li> Проверяйте аналитические пластины каждые 30 мин. <ol><li> Для аналитических пластинок с бактериальными пятнами положительно оценивайте организмы, если они достигают участка пищи в течение 4-х часов. Для отрицательных контрольных пластин положительно оценивайте организмы, если они пересекли барьер. </li></ol></li></ol>

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).</li>
<li>Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBargmann%2C+CI+%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22">The C. elegans Research Community, WormBook</a>. , wormbook.1.123.1, http://www.wormbook.org (2006).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+temperature-sensing+by+a+single+thermosensory+neuron+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>van Campen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+modulation+disorders+in+childhood+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurodev.+Disord%22%5BJournal%5D)">Sensory modulation disorders in childhood epilepsy.</a> J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).</li>
<li>Festa, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+disconnectivity+disrupts+sensory+integration+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsych%22%5BJournal%5D)">Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease.</a> Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).</li>
<li>Boecker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+in+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+disease%3A+investigations+with+3D+H%282%29%2815%29O-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET.</a> Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).</li>
<li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21154667">Modeling human disease in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li>
<li>O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+in+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">C. elegans in high-throughput drug discovery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 247-253 (2014).</li>
<li>Thompson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+million+mutation+project%3A+a+new+approach+to+genetics+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).</li>
<li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+status+and+serotonin+rapidly+and+reversibly+modulate+a+Caenorhabditis+elegans+chemosensory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).</li>
<li>Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v378/n6552/abs/378078a0.html">Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor.</a> Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).</li>
<li>Chalasani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li>
<li>Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signaling+pathways+mediate+touch+and+osmosensory+responses+in+a+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron.</a> J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).</li>
<li>Ishihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEN-1%2C+a+secretory+protein+with+an+LDL+receptor+motif%2C+regulates+sensory+integration+and+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 109 (5), 639-649 (2002).</li>
<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).</li>
<li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+status+and+serotonin+rapidly+and+reversibly+modulate+a+Caenorhabditis+elegans+chemosensory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).</li>
<li>Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPR-9%2C+a+Galanin-Like+G-Protein+Coupled+Receptor%2C+and+GLR-1+Regulate+Interneuronal+Circuitry+Underlying+Multisensory+Integration+of+Environmental+Cues+in+Caenorhabdities+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans.</a> PLoS Genet. 12 (5), (2016).</li>
<li>Harris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+amine+receptors+operating+at+different+levels+within+the+locomotory+circuit+are+each+essential+for+the+serotonergic+modulation+of+chemosensation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).</li>
<li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+serotonergic+food+signal+stimulating+sensory-mediated+aversive+behavior+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans.</a> PLoS One. 6 (7), (2011).</li>
<li>Mitchell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+role+for+neuropeptides+in+acute+and+chronic+adaptive+responses+to+alcohol%3A+behavioural+and+genetic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (5), (2010).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity%2C+discrimination%2C+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genet. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Behavior (July 3, 2006). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22">The C. elegans Research Community, WormBook</a>. Hart, A. C. , wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org (2006).</li>
<li>Sambongi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+cadmium+and+copper+ions+by+externally+exposed+ADL%2C+ASE%2C+ASH+neurons+elicits+avoidance+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans.</a> NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).</li>
<li>Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circuit+for+navigation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).</li>
<li>Rechavi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation-Induced+Transgenerational+Inheritance+of+Small+RNAs+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans.</a> Cell. 158 (2), 277-287 (2014).</li>
<li>Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((npr-1+Regulates+Foraging+and+Dispersal+Strategies+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+A+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Wang, S. J., Wang, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Track-A-Worm%2C+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PLoS One. 8 (7), (2013).</li>
</ol>

Нам нечего раскрывать.

Эта конструкция анализа изменяет анализ 24 продовольственной гонки, чтобы включить медный раствор для создания протективного срединного барьера и вокруг края пластины, чтобы предотвратить потерю нематод. Организмы тестируются на их способность преодолевать протективный барьер и достигать патча для пищи в течение 4-х часов. В контексте npr-9 (GF) мы использовали этот анализ для оценки того, как условия голодания могут влиять на отвратительные реакции и обнаружение пищи. При условии, что м...

Caenorhabditis elegans использовался как модель для изучения нейробиологии в течение десятилетий из-за относительной легкости анализа схем нервной системы, состоящей только из 302 нейронов 1 . При условии, что организм зависит от реагирования на экологические сигналы, большая часть нервной системы предназначена для регулирования интеграции экологических сигналов 2 . Несмотря на простоту своей нервной системы, C. elegans может обнаруживать и реагировать на различные экологические сигналы, включая репелленты 3 , аттрактанты 4 , температуру 5 и даже влажность 6 . Неспособность надлежащим образом интегрировать экологические сигналы были связаны с рядом поведенческих расстройств и нейродегенеративных состояний в модельных системах млекопитающих 7- 9. С рядом доступных моделей нейронных заболеваний<html> 10 в C. elegans и разработке фармацевтических экранов 11 нематод, этот организм оказался полезной системой для изучения нейробиологии. Учитывая наличие сопоставленного нематодного соединения 1 и мутаций почти для каждого гена в геноме 12 нематоды, наше понимание нервной системы нематод и, в свою очередь, наше собственное, частично ограничено разработкой творчески подходящих анализов. За последние 40 лет был разработан ряд анализов хемотаксиса для оценки реакции нематод на различные отклонения от априорных стимулов 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . Первоначальные эксперименты включали введение острого экологического стимула, в то время как один червь, брошенный на агаровой пластине= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Были зафиксированы немедленные изменения в локомоторных ответах. Например, летучий октанол одоранта можно наносить на волосы и доноситься перед носом нематоды, чтобы стимулировать инициирование обратной локомоции у червей дикого типа 17 . Были также разработаны более сложные анализы для включения нескольких переменных в качестве средства оценки поведенческого выбора 18 . Вариант этого анализа влечет за собой использование медного раствора для создания протективного срединного барьера 4 . Аттрактант, а именно диацетил, помещался с одной стороны химического барьера с червями, перенесенными из диацетильного источника. Черви, дефектные для медных отвратительных реакций, немедленно пересекали барьер, чтобы достичь диацетила, в то время как черви типа дикого типа первоначально были отбиты барьером. Ответы были оценены, когда черви впервые приблизились к медной барьерБез долгосрочных наблюдений. Когда черви оцениваются после условий голодания, их чувствительность к экологическим стимулам снижается 19 . Когда аверсивный химический октанол доносится до носа нематоды, организмы дикого типа стимулируют движение назад в течение 3-5 секунд при еде. После того как эти организмы были удалены из пищи в течение 10 мин, они проявляют задержанный ответ 8 - 10 с 20 . Таким образом, при повышенном голодании нематоды проявляют сниженный отвратительный ответ на вредные экологические сигналы, поскольку поиск пищи становится более важным для выживания. Напротив, нематоды, которые экспрессируют нейропептидный рецептор 9 ( npr-9) , не реагируют на октанол на или вне пищи и проявляют неспособность реагировать на ряд отвратительных стимулов 21 . Эти npr-9 (GF) организмы также не модулируют свою частоту разворота в присутствии пищи, но могутОбратные в ответ на суровые прикосновения, указывающие на то, что они способны к обратной локомоции 21 . Мы также оценили мутанты npr-9 (LF), учитывая, что они проявляют аномально уменьшенную частоту разворота от пищи, но могут модулировать их поведение в присутствии пищи 21 . Сочетание состояния питания червя с внедрением острых внешних раздражителей помогло в выяснении механизмов, с помощью которых связанный с пищей путь мог широко модулировать сенсорные сигнальные пути 22 , 23 . Присутствие пищи в среде нематод также использовалось для оценки ответов на вывод этанола 24 . В этом эксперименте черви инкубировали в различных концентрациях этанола и затем помещали на агаровую пластину с патчем с пищей, известным как «анализ расы пищи». Патч для еды был помещен на один край пластины, а нематоды wОтделяются от источника пищи. Вывод этанола оценивали путем измерения продолжительности времени, необходимого для того, чтобы черви достигли участка пищи. Этот анализ на основе питания, основанный на питании, основан на анализе продовольственной расы для интеграции дополнительных переменных окружения, а именно продуктов питания и меди, при оценке изменений поведения с течением времени. Это адаптация широко используемого протокола в сообществе C. elegans 4 . Этот протокол использовался для оценки аверсивных ответов и обнаружения пищи в течение четырехчасового периода 21 . Поскольку поведение вирусов, вызывающих голод червя после 30 минут депривации пищи 25 , мы также можем оценить, как изменения состояния питания могут влиять на экологические реакции. Условия этого анализа измеряют, как экспериментальные организмы изменяют отзывчивость к аверсивным стимулам с течением времени, следовательно, это оценивает поведенческие изменения какОрганизмы продвигаются к голодному состоянию (и продолжают измерения продолжительного голодания). Поскольку животные npr-9 (GF) не изменяют свое поведение в ответ на пищу или многие аверсивные сигналы, мы стремились определить, сохраняются ли эти поведенческие дефициты в контексте голодания. В конечном счете, эта конструкция анализа была разработана для специфической оценки мутантов npr-9 (GF), но может быть дополнительно адаптирована, чтобы также характеризовать новые штаммы.

<table><tbody><tr><td>M9 Solution [3 г KH2PO4, 6 г Na2HPO4, 5 г NaCl, 1 мл 1 М MgSO4, H2O до 1 литра. Провести стерилизацию в автоклаве перед использованием.]</td><td></td><td></td><td>Производится в лаборатории</td></tr><tr><td>Сульфат меди</td><td>Sigma</td><td>C-1297</td><td>Использовать воду для получения соответствующей суспензии с концентрацией 0,5 М</td></tr></tbody></table>

<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; Анализ на основе меди на основе питательных веществ

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Чтобы обеспечить выживание, организмы должны быть способны избегать неблагоприятных мест обитания, обеспечивая при этом постоянный источник пищи. Caenorhabditis elegans изменяют свои локомоторные закономерности при обнаружении разнообразных экологических стимулов и могут модулировать их набор поведенческих реакций в ответ на условия голодания. Нематоды обычно проявляют сниженный отвратительный ответ при удалении из источника пищи в течение более 30 мин. Наблюдение за поведенческими изменениями в ответ на меняющийся статус питания может дать представление о механизмах, которые регулируют переход от хорошо питающегося к голодному состоянию. Мы разработали анализ, который измеряет способность нематоды пересекать барьер аверсивного действия ( то есть медь), затем достигает источника пищи в течение длительного периода времени. Этот протокол основывается на предыдущей работе, интегрируя несколько переменных таким образом, который позволяет продолжать сбор данных, когда организмы смещаются в сторонуN все более голодное состояние. Более того, этот анализ позволяет увеличить размер выборки, чтобы одновременно можно было оценить большую популяцию нематод. Организмы, дефектные для способности обнаруживать или реагировать на медь, немедленно пересекают химический барьер, в то время как нематоды дикого типа изначально отталкиваются. Поскольку черви типа дикого типа становятся все более голодными, они начинают пересекать барьер и достигать источника пищи. Мы разработали этот анализ для оценки мутанта, который неспособен реагировать на различные экологические сигналы, включая пищевые ощущения или обнаружение отвратительных химических веществ. При оценке по этому протоколу дефектные организмы немедленно пересекали барьер, но также не могли обнаружить источник пищи. Следовательно, эти мутанты неоднократно пересекают химический барьер, несмотря на временное достижение источника пищи. Этот анализ может прямо проверять популяции червей для оценки потенциальных дефектов пути, связанных с отвращением и голоданием.

Использовали дикий тип (N2), npr-9 (tm1652) и сверхэкспрессию npr-9 , т. Е. Npr -9 (GF) (IC836 - npr -9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), чтобы оценить реакцию на голод и отторжение меди. Органы дикого типа способны обнаруживать и реагировать на аверсивный медный барьер, в то время как мутанты npr-9 (GF) не инициируют отвратительный ответ на медь в течение 4 ч анализа 21 . Через 30 минут голодани...

Здесь мы представляем специфический анализ Caenorhabditis elegans, предназначенный для оценки изменений поведения отвращения меди и способности находить общий источник пищи, так как организм развивается из сытого и голодного состояния питания.

<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Анализ на основе меди на основе питательных веществ

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Основная цель этого анализа аверсии к меди на основе питательного статуса заключается в оценке реакции нематоды на отталкивающее химическое вещество и источник пищи в течение четырех часов. Это позволяет осуществлять одновременную оценку питательного статуса. Этот метод может помочь в области поведенческой нейронауки, выявляя мутанты, которые не могут модулировать локомоторные паттерны и реагировать на отталкивающее химическое вещество даже при условиях голодания.Основное преимущество этой техники заключается в том, что ее можно проводить в течение длительного времени, что позволяет проводить анализ питательного статуса, поскольку черви становятся все более голодными в течение четырех часов. Для подготовки экспериментальных организмов к анализу выберите 10 нематод стадии L4 на каждый поток за 24 часа до начала анализа, чтобы убедиться, что организмы являются молодыми взрослыми при проведении теста. Для каждого мутанта или контрольной нематоды выберите 10 L4.Содержите организмы L4, используя стандартные методы в течение 24 часов на стандартных агар-пластинках, засеянных OP50 E.Coli. За 24 часа до анализа с помощью линейки и толстого маркера нарисуйте линию на нижней стороне предварительно подготовленной среды для роста нематод или пластинки NGM вдоль наружного края. Отметьте среднюю барьерную линию, равноудаленную от каждого края пластинки.Засейте пластинку 50 микролитрами OP50 E.Coli только на одной стороне барьера из меди, чтобы создать равномерный ковёр. Используйте отмеченные линии на нижней стороне пластинки, чтобы убедиться, что бактерии не соприкасаются с медным раствором. Убедитесь, что медный раствор выстлает край пластинки и образует среднюю барьерную линию, и перенесите бактерии так, чтобы медный раствор не соприкасался с источником пищи.Отметьте вторую партию пластинок без OP50 E.Coli, чтобы они служили отрицательным контролем. Оставьте бактерии высыхать, а затем инкубируйте пластинки при 37 градусах Цельсия ночью. Убедитесь, что пятна бактерий не нарушаются при переносе нематод в инкубатор температурой 37 градусов Цельсия.Чрезмерное воздействие может изменить местоположение или форму пятна пищи. После ночной инкубации извлеките пластинки из инкубатора и с помощью отмеченной нижней стороны пластинки в качестве ориентира напишите 100 микролитров свежеприготовленного 0,5 молярного раствора сульфата меди (II) на край агар-пластинки, чтобы создать внешний медный барьер. Напишите 25 микролитров раствора сульфата меди (II), чтобы создать среднюю барьерную линию.Убедитесь, что раствор сульфата меди (II) не соприкасается с пятном бактерий, и дайте медному раствору высохнуть на пластинке. Проверяйте сухость каждые пять минут после переноса, легко прикасаясь к раствору у края пластинки с лабораторной салфеткой. Непосредственно перед анализом перенесите экспериментальные организмы на пластинку с агаром без бактерий и позвольте нематода перемещаться свободно в течение одной минуты, чтобы удалить избыточные бактерии.Затем напишите один миллилитр M9 на пластинку с молодыми взрослыми, которые были перенесены за 24 часа до этого, чтобы промыть червей в микроцентрифужной пробирке. Центрифугируйте нематод при 3000 x G в течение одной минуты. Черви должны образовать осадок на дне пробирки.Отсасывайте раствор M9, не разрушая осадок червей. Добавьте один миллилитр раствора M9 к осадку червей. Переверните пробирку, чтобы смешать червей с раствором.Если избыточные бактерии были изначально перенесены с червями, повторяйте процесс всего пять раз. После последней промывки отсасывайте супернатант до тех пор, пока не останется 100 микролитров раствора M9 и осадок червей. Немедленно перенесите червей из раствора после завершения процесса промывания.Напишите 20 микролитров осадка червей из дна пробирки на свободную от бактерий половину пластинки анализа, убедитесь, что 10 червей перенесены на пластинку анализа и что на ней не содержится загрязняющая пища. Никакие бактерии не должны переноситься на пластинки с гонкой на медь. Удалите избыток раствора M9 с нематод лабораторной салфеткой в течение одной минуты.Убедитесь, что раствор M9 не соприкасается с раствором сульфата меди (II) и что черви и поверхность агаров остаются неповрежденными. Удалите червей, случайно удаленных лабораторной салфеткой. После удаления раствора M9 и начала червями нежидких локомоторных паттернов, то есть когда они перестали метать лапками.Запустите секундомер анализа, если случайно были включены дополнительные черви, удалите их, выбирая с помощью галокарбонного масла, чтобы убедиться, что на пластинку не добавлены бактерии. Проверяйте пластинки анализа каждые 30

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Нейронауки

Здесь мы приводим протокол для проведения твердой пластиной, основанных на пищевых ограничений...

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Это видео представляет краткосрочный анализ выживаемости, который проверяет лечение на острую токсичность или проверяет генетический штамм на устойчивость к токсическому состоянию. Пример протокола показывает пример теста на выживаемость, в котором черви проверяются на их способность противостоять окислительному стрессу, вызванному паракватом (PQ).

С. elegans Анализ выживаемости: краткосрочный тест на токсичность

Это видео знакомит с хемотаксисом у нематоды C. elegans и показывает протокол примера, проверяющий хемотаксическое отвращение к сульфату меди.

С. elegans Анализ хемотаксиса: метод проверки хемоощущения у червей

Чтобы изучить взаимосвязь между белковым гомеостазом, стрессом и старением, мы отслеживали изменения в сворачивании белка, отслеживая белковую дисфункцию, локализацию белка в клетке и стабильность белка на организменном, клеточном и белковом уровнях, используя генетически податливого многоклеточного Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы.

Использование Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы для изучения белкового гомеостаза в многоклеточном организме

C. elegans является полезной моделью для изучения воздействия этанола на поведение. Мы представляем поведенческий анализ, который количественно оценивает влияние этанола на скорость локомоции ползающих червей; как первоначальную чувствительность, так и развитие острой функциональной толерантности к этанолу можно измерить с помощью этого анализа.

Анализ по измерению влияния этанола на локомоции Скорость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения путей передачи сигналов, участвующих в устойчивости к окислительному стрессу. Здесь мы приводим протокол измерения устойчивости к окислительному стрессу животных C. elegans в жидкой фазе с использованием нескольких окислителей в 96 луночных планшетах.

Измерение окислительного стрессоустойчивость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В микротитровальных пластинках 96-а

Мы представляем установку регистрации записи и протокол, который позволяет автоматизировать анализ нематод, предпочтение Caenorhabditis elegans для растворимых соединений в популяционном анализе. В этой статье описывается построение камеры поведения, протокола поведенческого анализа и использования программного обеспечения для анализа видео.

Автоматизированный анализ хемосенсорного предпочтения на основе нематод

Количественный метод был разработан для выявления и прогнозирования острой токсичности химических веществ, автоматически анализируя фенотипического профилирование Caenorhabditis elegans. Этот протокол описывает, как для лечения червей с химическими веществами в 384-ну пластине, захвата видео и количественно токсикологические связанных фенотипов.

Высок объём Assay для прогнозирования химической токсичности путем автоматизированного фенотипические профилирование Caenorhabditis elegans

Здесь мы характеризуем клеточные протеотоксические реакции стресса в нематоде C. elegans путем измерения активации флуоресцентных транскрипционных репортеров и просказа чувствительности к физиологическому стрессу.

Измерения физиологических стрессовых реакций у C. Elegans

Здесь мы представляем протокол культивирования изолированных отдельных нематод на твердых средах для отслеживания физиологических параметров на протяжении всей жизни и количественной оценки флуоресценции. Эта система культивирования включает в себя барьер пальмитиновой кислоты вокруг лунок с одним червяком, чтобы предотвратить бегство животных, что позволяет использовать аверсивные вмешательства, включая патогенные бактерии и химические стрессоры.

Долгосрочное культивирование отдельных Caenorhabditis elegans на твердых средах для продольного флуоресцентного мониторинга и аверсивных вмешательств

В этом протоколе описан анализ для количественной оценки скорости кормления Caenorhabditis elegans на основе измерения клиренса бактерий в жидкой культуре.

Количественная оценка потребления пищи при Caenorhabditis elegans путем измерения бактериального клиренса

Изучите анализ медной аверсии Caenorhabditis elegans на основе питательного статуса для поведенческой нейробиологии. Этот метод позволяет оценивать изменения поведения червей при голодании в течение четырёх часов.

Больше видео