26 июля 2017 г.
Здесь мы представляем специфический анализ Caenorhabditis elegans, предназначенный для оценки изменений поведения отвращения меди и способности находить общий источник пищи, так как организм развивается из сытого и голодного состояния питания.
Основная цель этого анализа аверсии к меди на основе питательного статуса заключается в оценке реакции нематоды на отталкивающее химическое вещество и источник пищи в течение четырех часов. Это позволяет осуществлять одновременную оценку питательного статуса. Этот метод может помочь в области поведенческой нейронауки, выявляя мутанты, которые не могут модулировать локомоторные паттерны и реагировать на отталкивающее химическое вещество даже при условиях голодания.
Основное преимущество этой техники заключается в том, что ее можно проводить в течение длительного времени, что позволяет проводить анализ питательного статуса, поскольку черви становятся все более голодными в течение четырех часов. Для подготовки экспериментальных организмов к анализу выберите 10 нематод стадии L4 на каждый поток за 24 часа до начала анализа, чтобы убедиться, что организмы являются молодыми взрослыми при проведении теста. Для каждого мутанта или контрольной нематоды выберите 10 L4.
Содержите организмы L4, используя стандартные методы в течение 24 часов на стандартных агар-пластинках, засеянных OP50 E.Coli. За 24 часа до анализа с помощью линейки и толстого маркера нарисуйте линию на нижней стороне предварительно подготовленной среды для роста нематод или пластинки NGM вдоль наружного края. Отметьте среднюю барьерную линию, равноудаленную от каждого края пластинки.
Засейте пластинку 50 микролитрами OP50 E.Coli только на одной стороне барьера из меди, чтобы создать равномерный ковёр. Используйте отмеченные линии на нижней стороне пластинки, чтобы убедиться, что бактерии не соприкасаются с медным раствором. Убедитесь, что медный раствор выстлает край пластинки и образует среднюю барьерную линию, и перенесите бактерии так, чтобы медный раствор не соприкасался с источником пищи.
Отметьте вторую партию пластинок без OP50 E.Coli, чтобы они служили отрицательным контролем. Оставьте бактерии высыхать, а затем инкубируйте пластинки при 37 градусах Цельсия ночью. Убедитесь, что пятна бактерий не нарушаются при переносе нематод в инкубатор температурой 37 градусов Цельсия.
Чрезмерное воздействие может изменить местоположение или форму пятна пищи. После ночной инкубации извлеките пластинки из инкубатора и с помощью отмеченной нижней стороны пластинки в качестве ориентира напишите 100 микролитров свежеприготовленного 0,5 молярного раствора сульфата меди (II) на край агар-пластинки, чтобы создать внешний медный барьер. Напишите 25 микролитров раствора сульфата меди (II), чтобы создать среднюю барьерную линию.
Убедитесь, что раствор сульфата меди (II) не соприкасается с пятном бактерий, и дайте медному раствору высохнуть на пластинке. Проверяйте сухость каждые пять минут после переноса, легко прикасаясь к раствору у края пластинки с лабораторной салфеткой. Непосредственно перед анализом перенесите экспериментальные организмы на пластинку с агаром без бактерий и позвольте нематода перемещаться свободно в течение одной минуты, чтобы удалить избыточные бактерии.
Затем напишите один миллилитр M9 на пластинку с молодыми взрослыми, которые были перенесены за 24 часа до этого, чтобы промыть червей в микроцентрифужной пробирке. Центрифугируйте нематод при 3000 x G в течение одной минуты. Черви должны образовать осадок на дне пробирки.
Отсасывайте раствор M9, не разрушая осадок червей. Добавьте один миллилитр раствора M9 к осадку червей. Переверните пробирку, чтобы смешать червей с раствором.
Если избыточные бактерии были изначально перенесены с червями, повторяйте процесс всего пять раз. После последней промывки отсасывайте супернатант до тех пор, пока не останется 100 микролитров раствора M9 и осадок червей. Немедленно перенесите червей из раствора после завершения процесса промывания.
Напишите 20 микролитров осадка червей из дна пробирки на свободную от бактерий половину пластинки анализа, убедитесь, что 10 червей перенесены на пластинку анализа и что на ней не содержится загрязняющая пища. Никакие бактерии не должны переноситься на пластинки с гонкой на медь. Удалите избыток раствора M9 с нематод лабораторной салфеткой в течение одной минуты.
Убедитесь, что раствор M9 не соприкасается с раствором сульфата меди (II) и что черви и поверхность агаров остаются неповрежденными. Удалите червей, случайно удаленных лабораторной салфеткой. После удаления раствора M9 и начала червями нежидких локомоторных паттернов, то есть когда они перестали метать лапками.
Запустите секундомер анализа, если случайно были включены дополнительные черви, удалите их, выбирая с помощью галокарбонного масла, чтобы убедиться, что на пластинку не добавлены бактерии. Проверяйте пластинки анализа каждые 30
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен специфический для Caenorhabditis elegans метод анализа для оценки поведения по избеганию меди и поиска источника пищи при переходе организма из состояния сытости в состояние голодания.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Поведенческая нейробиология
- Биология нематод
Теоретические сведения
- Данный анализ позволяет оценить реакцию нематод на отталкивающий химический агент и источник пищи.
- Метод позволяет оценить поведенческие изменения в течение четырехчасового периода.
- Этот метод позволяет выявить мутантов, которые не корректируют характер локомоции в условиях голодания.
- Метод позволяет проводить анализ нутритивного статуса по мере прогрессирующего голодания червей.
Цель исследования
- Оценить изменения в поведении C. elegans при избегании меди.
- Оценить способность находить источники пищи при различных состояниях питания.
- Внести вклад в понимание поведенческих реакций в условиях голодания.
Используемые методы
- Анализ проводился в течение четырехчасового периода.
- Для тестирования использовались нематоды на стадии L4.
- Одновременная оценка нутритивного статуса и поведения.
- Отбор 10 нематод стадии L4 на один поток для проведения эксперимента.
Основные результаты
- Выявлены поведенческие изменения в ответ на отвращение к меди.
- Продемонстрирована способность нематод находить источники пищи, несмотря на голодание.
- Подчеркнута эффективность данного анализа в исследованиях в области поведенческой нейробиологии.
- Показано, что анализ может быть продлен во времени для проведения комплексного исследования.
Выводы
- Данный анализ является ценным инструментом для изучения поведенческих реакций C. elegans.
- Он помогает выявлять мутантов с измененными реакциями избегания.
- Этот метод расширяет понимание влияния нутриентного статуса на поведение.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный анализ позволяет исследователям в области поведенческой нейробиологии оценить, как нутритивный статус модулирует аверсивные реакции в генетически модифицируемой модели. Отслеживание реакции отвращения к меди и пищевого поведения с течением времени способствует механистическому снижению рисков при изучении мишеней, участвующих в сенсорной интеграции и регуляции питания. Этот метод обеспечивает прогностическую достоверность при валидации мишеней в путях, связывающих метаболическое состояние с поведенческим ответом.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы о том, как нутритивный статус регулирует аверсивные химические реакции.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем измерения модуляции двигательных паттернов в ответ на комбинированные сенсорные стимулы.
- Прогностическая ценность: помогает в приоритизации портфеля за счет выявления мутантов, которые не способны интегрировать сигналы голодания с поведением избегания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений, влияющих на сенсорную интеграцию.
- Практическая ценность: Стандартизация количественных показателей поведения при длительном наблюдении для повышения воспроизводимости анализа.
- Масштабируемость: Позволяет увеличить размер выборки для одновременной оценки больших популяций, что повышает производительность скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает поведенческие фенотипы, выявленные на этапе открытия, с доклиническими моделями регуляции питания и сенсорной обработки.
- Продвижение с учетом рисков: Поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), определяя, влияют ли мишени на адаптивное поведение при изменении метаболических условий.
- Механистическое снижение рисков: Сосредоточен на мишенях, модулирующих поведенческую гибкость, а не на статическом отвращении или привлекательности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум исследований — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений, особенно для путей, связывающих нутриентный статус с поведенческими реакциями.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезы о том, как метаболические сигналы модулируют аверсивные реакции в нейронных цепях.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного, воспроизводимого количественного определения поведения при пересечении барьера в течение четырех часов.
- Аналитика: позволяет получать зависящие от времени поведенческие показатели, что дает возможность сравнивать генетические или фармакологические условия.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем моделирования влияния нутритивного статуса на принятие решений в простых нервных системах.
- Повторное использование в масштабе предприятия: служит многоразовой платформой для оценки множества мишеней в путях сенсорной интеграции и пищевого поведения.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени, выявляя динамические поведенческие реакции на комбинированные аверсивные и аппетитивные стимулы.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость благодаря хронометрированной оценке и контролируемым условиям окружающей среды.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снижать риски, связанные с мишенями, модуляция которых не приводит к адаптации поведения в условиях метаболического стресса.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию с учетом рисков, разграничивая статические сенсорные дефекты и дефицит динамической интеграции.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с нематодами, навыки поведенческого наблюдения и проведения анализов с точно заданным временем.
- Зависит от использования стандартизированных агариков, приготовления раствора сульфата меди и контроля бактериального газона.
- Необходимо согласование критериев оценки между командами для фиксации моментов прибытия к пищевому пятну и пересечения барьера.
- Требуется учет особенностей адаптации при переносе анализа на другие генетические линии или при воздействии различных стрессовых факторов окружающей среды.
- Включает такие практические ограничения, как недопущение физического разрушения медных барьеров при переносе червей и поддержание стабильных условий инкубации.
