Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы определить оптимальное хромосомное положение любого данного элемента ДНК с помощью случайной вставки, опосредованной транспозонами, конкурсных экспериментов и секвенирования всего генома. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репликации ДНК, такие как важность хромосомного расположения генетического элемента. Преимущество этой методики заключается в том, что она сочетает случайную вставку на основе транспозона с выбором наиболее приспособленного клона по преимуществу роста.

Здесь все упрощено за счет региона E.coli DARS2. Хотя этот метод может дать представление о хромосомной организации кишечной палочки, он также может быть применен к другим бактериям. После подготовки электрокомпетентных клеток, таких как MG1655 delta DARS2, в соответствии с текстовым протоколом, добавьте один микрограмм pNKBOR DARS2 в 40 микролитров клеток и переложите смесь в предварительно охлажденную стерильную кювету с зазором 0,2 сантиметра.

Вставьте кювету в камеру электропорации. Затем электропорируйте элементы при напряжении 18 киловольт, 500 Ом и 25 микрофарадах. Постоянная времени должна составлять около пяти миллисекунд, и дуги не должно возникать.

Быстро восстановите бактериальную суспензию, повторно суспензируя ее в одном миллилитре предварительно подогретого отвара LB и переложите в 15-миллилитровую пробирку. Инкубируйте клетки в условиях аэрированного роста при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут без выбора антибиотиков. Затем поместите бактерии на агаровые пластины LB с добавлением 50 микрограммов канамицина на миллилитр и инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день подсчитайте колонии от электропорации. Одна колония считается равной одной вставке хромосомного транспозона. Добавьте по одному миллилитру бульона LB на каждую тарелку и смойте все колонии.

Повторно используйте тот же один миллилитр бульона LB для увеличения концентрации бактерий. Затем объедините все колонии в одной 50-миллилитровой пробирке. Сделайте пробирку вихревой, чтобы заморозить исходный материал, и смешайте один миллилитр клеточной суспензии с одним миллилитром 50% глицерина на льду.

Переложите трубочки в сухой лед на 10 минут. После того, как культуры будут заморожены, перенесите их в морозильную камеру с отрицательным температурой 80 градусов по Цельсию. Разморозьте библиотеку транспозонов с отрицательных 80 градусов Цельсия на льду.

Перемешайте с помощью пипетирования, затем перенесите 100 микролитров библиотеки транспозонов в 10 миллилитров LB в 15-миллилитровую пробирку. Выращенные клетки аэрируются непрерывным встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми часов до неподвижной фазы. По желанию отрегулируйте параметры в соответствии с различными условиями роста.

Для размножения бактериальной популяции примерно каждые 10 поколений переведите 10 микролитров ранее неподвижной фазы в 10 миллилитров свежей предварительно подогретой среды и выращивайте культуру еще восемь часов до стационарной фазы. После каждых 100 поколений соревнований сохраняйте пять образцов объемом в один миллилитр и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Подготовьте зонд для Южного блоттинга на участке NKBOR объемом в один килобайт с помощью ПЦР-амплификации с использованием специальных праймеров, перечисленных здесь.

Запустите образцы с помощью следующей программы. Пометить полученный фрагмент ПЦР меченым P32 dATP с использованием системы случайных праймеров по Смиту и получить общую клеточную ДНК в соответствии с текстовым протоколом. Расщепите всю клеточную ДНК с помощью Pvul, который разрезает NKBOR, содержащий интересующую область за пределами области, охватываемой зондом.

Проведите Южный блоттинг с использованием 0,7% агарозного геля по Лёбнеру-Ольсену и фон Фрайслебену. Чтобы использовать простой обход генов для идентификации сайтов вставки DARS2 из одиночных клонов, после 700 предполагаемых поколений конкуренции изолируйте геномную ДНК для матрицы ПЦР, сначала распределив бактерии на агаровой пластине LB, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Инокулируйте бульон LB отдельными колониями и выращивайте их в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.

Затем перелейте 20 микролитров в 200 микролитров автоклавной дистиллированной воды. Смешайте колонии вихрем в раствор, затем нагрейте смесь до 100 градусов Цельсия в течение 10 минут. Центрифугируйте образцы на максимальной скорости в течение пяти минут, затем сохраните лизат клеток при температуре минус 20 градусов Цельсия для использования в будущем.

Затем спроектируйте три вложенных грунтовки для отжига в выбранном транспозоне, как показано здесь. Используйте 200 нанограммов геномной ДНК, вложенный праймер и случайный праймер для приготовления 20-микролитровой ПЦР-реакции. Затем запустите образцы с помощью следующей программы.

Для второй амплификации используйте один микролитр первой реакции в качестве шаблона и используйте вложенные два праймера и такой же случайный праймер. Проведите третью реакцию аналогичным образом, используя вложенный праймер три, тот же случайный праймер и один микролитр от второй реакции в качестве шаблона. Запустите продукты из финальной ПЦР-реакции на 1,5%-ном агарозном геле и статине с бромидом этидия.

Вырежьте полосу в диапазоне от 100 до 800 пар оснований и изолируйте ДНК с помощью любого коммерческого набора для экстракции геля ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Для проведения проточной цитометрии необходимо сбалансировать каждую бактериальную культуру, поддерживая ее в фазе экспоненциального роста в течение не менее 10 поколений. Измерьте внешний диаметр 600 и убедитесь, что он никогда не превышает 0,3.

Для проведения выбега рифампицина по текстовому протоколу необходимо перенести один миллилитр культуры в 15-миллилитровую пробирку, содержащую 30 микролитров РИФ-ЦЭФ. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение минимум четырех часов. Для образца EXP переложите один миллилитр экспоненциально растущей культуры в 1,5-миллилитровую пробирку со льдом.

Затем соберите клетки путем центрифугирования при температуре 15 000 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах ледяного 10 миллимолярного триса pH 7,5 и добавьте один миллилитр ледяного 77% этанола. Храните образцы при температуре четыре градуса Цельсия до использования.

Окрашивайте клетки, собирая от 100 до 300 микролитров неподвижных клеток центрифугированием при 15 000 перегрузках в течение 15 минут. Удалите надосадочную жидкость и используйте 130 микролитров раствора для окрашивания ДНК для повторного суспендирования гранулы. Затем инкубируйте образцы на льду и в темноте в течение 10 минут.

Наконец, используйте проточную цитометрию для определения происхождения каждой клетки, относительной клеточной массы и относительного содержания ДНК. После экстракции ДНК из первоначального пула транспозонов и каждых примерно 100 из 700 поколений конкурентов ДНК разрезали с помощью Pvul, который, как известно, разрезает транспозон NKBOR DARS2 один раз в регионе, не охваченном зондом, и проводили Саузерн-блоттинг. Как показано здесь, в первоначальном пуле DARS2 отсутствовали отдельные полосы, что показывает, что DARS2 был вставлен случайным образом по всей хромосоме.

Со временем сложилась закономерность, при которой первоначальный большой пул клонов DARS2 превратился только в одного или нескольких персистирующих клонов DARS2. Секвенирование всего генома было использовано для идентификации сайтов вставки DARS2 из стартового пула. И после 400, 500 и 700 поколений конкуренции в репрезентативном подмножестве секвенированных вставок, 98% всех вставок DARS2 были обнаружены близко к расположению хромосом дикого типа DARS2.

И 2% были обнаружены в других местах хромосомы. Ранее было показано, что клетки с дефицитом DARS2 инициируют репликацию синхронно и имеют снижение исходной концентрации по сравнению с клетками дикого типа. В этом случае присутствие элемента DARS2 в конечной точке не восстанавливает синхронность или содержимое клеточного источника до уровней дикого типа, в то время как выбранные клоны DARS2 IR и RPPH инициируют синхронную репликацию.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить оптимальное хромосомное положение того или иного элемента ДНК. Это делается путем случайных вставок на основе транспозонов, за которыми следуют конкурсные эксперименты и, наконец, секвенирование всего генома.