Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids
11 августа 2017 г.
Мы предоставляем обобщенных протокол, основанный на стратегии microfluidic подложке для инженерных microfibrous сосудистого русла, где тип средней ячейки можно далее посеяны в интерстициального пространства этой microfibrous структуры для создания васкуляризированной ткани и organoids.
Общая цель этой методологии микрофлюидной биопечати заключается в создании васкуляризированной тканевой конструкции. Этот метод может решить ключевые вопросы в области биопроизводства васкуляризированных тканей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он универсален в создании трехмерного сосудистого чана с контролируемой формой для инженерии васкуляризированных тканей с помощью процесса вторичного посева клеток.
Хотя этот протокол дает представление о создании васкуляризированных тканей сердца, он также может быть применен ко многим другим типам тканей, таким как печень, кожа и даже рак. Обычные люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что настройка биопринтера может быть непростой. Чтобы начать эту процедуру, сконструируйте двухслойную концентрическую микрофлюидную печатающую головку, вставив меньшую тупую иглу, служащую сердцевиной, в центр более крупной тупой иглы, служащей оболочкой.
Следите за тем, чтобы стержень иглы выступал из внешней оболочки примерно на один миллиметр. После этого вставьте иглу 23 калибра в ствол центральной иглы в обратном направлении. Сделайте отверстие сбоку от туловища от внешней иглы и вставьте соответствующий по размеру металлический соединитель
.Заклеить эпоксидным клеем. Установите экструдер на головку биопринтера с помощью держателя из полиметилметакрилата или ПММА. Затем для впрыска биочернил и сшивающего раствора через две трубки из ПВХ по отдельности подключите входные отверстия печатающей головки к двухканальному шприцевому насосу.
Сделайте биочернила, используя смесь альгината, гельМА и фотоинициатора. Растворен в 25 миллимолярном буфере HEPES, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки или FBS. Затем приготовьте раствор 0,3 моляра хлорида кальция в буфере HEPES, содержащем 10% FBS, в качестве сшивающей несущей жидкости.
Непосредственно перед биопечатью трипсинизируйте эндотелиальные клетки пупочной вены человека или HUVEC в течение 5-10 минут. Центрифугируйте клетки при 800 об/мин в течение пяти минут в 15-миллилитровой пробирке. Ресуспендируйте клетки в биочернилах в концентрации от пяти до 10 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр, медленно пипетируя от пяти до 10 раз.
Затем с помощью двухканального шприцевого насоса начните впрыскивание биочернил HUVECs через один канал, а сшивающей жидкости через другой канал со скоростью потока пять микролитров в минуту. Дайте потокам непрерывно работать в течение одной минуты, пока они не стабилизируются. После этого начните движение печатающей головки, поддерживая скорость наплавки биопринтера на уровне примерно четырех миллиметров в секунду.
Эта биопечать должна привести к быстрому ионному гелеобразованию альгинатного компонента и осаждению каркаса из микрофибры. После того, как каркас будет напечатан, сшите компонент gelMA с помощью ультрафиолетового излучения мощностью от 5 до 10 милливатт на квадратный сантиметр в течение 20-30 секунд для достижения химического гелеобразования. Затем удалите излишки хлорида кальция со скаффолда, аккуратно промыв его теплой температурой 37 градусов Цельсия PBS.
Культивируйте этот каркас в среде для роста эндотелиальных клеток при температуре 37 градусов Цельсия в пяти объемных процентах CO2 в течение 16 дней. Меняйте среду не реже одного раза в два дня. В период культивирования наблюдайте за HUVEC под микроскопом до тех пор, пока они не мигрируют на периферию микроволокон каркаса и не образуют просветоподобные структуры.
Затем осторожно удалите всю среду из внутритканевого пространства каркаса с капиллярной силой с помощью куска стерильной фильтровальной бумаги. Мгновенно добавьте каплю суспензии вторичного типа клеток, таких как кардиомиоциты, поверх каркаса, что позволит клеткам проникнуть во все интрастициальное пространство. После этого инкубируйте этот каркас в инкубаторе от 30 минут до двух часов, позволяя клеткам прилипнуть к отдельным микроволокнам.
Удалите неадгезивные клетки, аккуратно промойте каркас PBS. Культивируйте этот каркас в соответствующей среде до тех пор, пока не сформируется желаемая васкуляризированная ткань. Описанная здесь микрофлюидная биопечать позволяет проводить прямую биопечать микроволокнистых каркасов с использованием биочернил с низкой вязкостью.
Каркас размером шесть на шесть на шесть квадратных миллиметров<содержащий более 30 микроволокон, может быть напечатан на биопринтере в течение 10 минут. Вид сверху и сбоку микрофотографий каркаса показывает превосходную структурную целостность в процессе биопечати. Достигается за счет немедленного ионного сшивания альгинатного компонента с хлоридом кальция.
После микрофлюидной экструзии биочернил, ионного сшивания и фотосшивки HUVEC сохранили относительно высокую жизнеспособность. Клетки пролиферировали и мигрировали из первоначально случайного распределения в нулевой день на периферию микроволокон на 16-й день. Кардиомиоциты неонатальных крыс, которые были посеяны на каркасе, созрели и заселили каркас.
Они показали сильную экспрессию функциональных сердечных биомаркеров. Такие как саркомерный альфа-актинин и коннексин 43. Конфокальная микроскопия биопечатного микрофиброзного каркаса, населенного кардиомиоцитами, выявила сосуществование как HUVEC, так и кардиомиоцитов.
HUVEC в основном присутствуют в границах микроволокон, в то время как кардиомиоциты окружают внешнюю часть микроволокон. Клетки были способны поддерживать свое спонтанное и синхронное биение в течение от девяти до 28 дней. В зависимости от источника ячеек и конфигурации скаффолдов.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как производить васкуляризированные ткани с помощью метода микрофлюидной биопечати, а также о изготовлении печатающей головки и операциях биопринтера. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку изготовление печатающей головки и работа биопринтера могут быть сложными для людей, которые раньше им не пользовались. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что две иглы должны быть концентрическими в печатающей головке и дать потоку стабилизироваться перед началом биопечати.
С развитием этого метода исследователи в области тканевой инженерии и биопроизводства теперь имеют еще один инструмент, позволяющий создавать васкуляризированные тканевые конструкции либо с целью регенерации in vivo, либо для моделирования тканей in vitro.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена методология микрофлюидного биопринтинга, направленная на создание васкуляризированных тканевых конструкций. Эта техника решает проблемы в области биоизготовления, позволяя создавать трехмерное сосудистое русло, которое может быть заселено вторичными типами клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биоизготовление
- Микрофлюидика
- Инженерия тканей
Фон
- Создание васкуляризированных тканей важно для развития органоидов.
- Существующие методы сталкиваются с ограничениями при создании сложных тканевых структур.
- Микрофлюидный биопринтинг предлагает гибкий подход для преодоления этих задач.
- Эта техника может быть адаптирована для различных типов тканей, включая сердечные, печеночные и кожные ткани.
Цель исследования
- Разработать протокол для создания васкуляризированных тканевых конструкций.
- Улучшить понимание техник биоизготовления.
- Создать основу для будущих приложений в инженерии тканей.
Используемые методы
- Конструкция многоярусной микрофлюидной печатающей головки.
- Использование меньшей тупой иглы в качестве ядра внутри большей тупой иглы.
- Засевка вторичных типов клеток в микрофиброзную структуру.
- Применение метода к различным типам тканей, помимо сердечных тканей.
Основные результаты
- Протокол успешно создает васкуляризированную тканевую конструкцию.
- Продемонстрирована гибкость в создании различных типов тканей.
- Предоставлены знания по инженерии сложных тканевых структур.
- Определены потенциальные трудности для новичков в процессе биопринтинга.
Выводы
- Метод микрофлюидного биопринтинга эффективен для инженерии васкуляризированных тканей.
- Этот подход может способствовать прогрессу в исследованиях органоидов.
- Будущие исследования могут расширить его применение к другим типам тканей и условиям.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Microfluidic bioprinting enables the engineering of vascularized tissue constructs with high structural fidelity, addressing a critical bottleneck in preclinical model development. By generating perfusable microvascular networks within hydrogel scaffolds, this method supports the creation of more physiologically relevant tissue models for drug screening and mechanistic studies. The approach enhances predictive confidence in early discovery by providing a tunable platform to study cell-cell interactions, tissue maturation, and functional responses under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial-pericyte or stromal cell interactions within a defined vascular niche to validate therapeutic targets involved in angiogenesis or vascular permeability.
- Operational Value: Provides a reproducible, microfluidically controlled system for generating vascularized scaffolds with consistent microfiber architecture and lumen formation.
- Predictive Value: Supports assessment of compound effects on vascular integrity and cell migration in a human-relevant, 3D microenvironment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized microfibrous scaffolds with encapsulated endothelial cells that form lumen-like structures, enabling quantitative assessment of vascular network formation over time.
- Operational Value: Compatible with dual-channel syringe pump bioprinting, allowing precise control over bioink and crosslinking fluid delivery for high-throughput scaffold fabrication.
- Assay Readiness: Produces scaffolds with >30 microfibers in a 6x6x6 mm volume within 10 minutes, supporting scalable preparation for downstream secondary cell seeding and compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables secondary seeding of cardiomyocytes or other parenchymal cells into the interstitial space, facilitating the study of vascularized tissue maturation and synchronized contractile function.
- Translational Continuity: Supports long-term culture (>16 days) with monitoring of cell migration, lumen formation, and biomarker expression (e.g., sarcomeric alpha actinin, connexin 43) to model tissue-level responses.
- Risk Mitigation: Allows evaluation of cell viability, proliferation, and functional maturation under perfusion-like conditions, reducing attrition due to poor vascular engraftment in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a vascularized platform that bridges simple monocultures and complex in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vascular-dependent pathways by enabling controlled co-culture of endothelial and parenchymal cells in a defined 3D geometry.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with reproducible microstructure and endothelialization, suitable for evaluating compound effects on vascular stability and tissue organization.
- Analytics: Enables quantitative readouts via confocal microscopy of cell distribution, lumen formation, and biomarker co-localization to assess tissue quality and functional maturation.
- Translational Research: Models vascularized tissue development from early endothelial network formation to secondary cell integration, supporting preclinical validation of vascular-targeted or regenerative candidates.
- Enterprise Reuse: The microfluidic printhead design and bioink system (GelMA-alginate with ionic/photocrosslinking) represent a reusable platform adaptable to multiple tissue types (cardiac, liver, skin) and secondary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by generating vascularized tissues with perfusable lumen-like structures and sustained cellular function (e.g., synchronized beating up to 28 days).
- Operational Value: Enables standardization of scaffold fabrication through microfluidic flow control, reducing variability in microfiber diameter, crosslinking efficiency, and cell distribution.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early insight into vascular compatibility and tissue-level responses, reducing late-stage failure due to inadequate vascularization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on their effects in a human-relevant, vascularized tissue model that recapitulates key structural and functional hallmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including concentric needle assembly and epoxy sealing to prevent leakage.
- Dependent on dual-channel syringe pump systems and UV photocrosslinking equipment for precise bioink delivery and GelMA stabilization.
- Necessitates optimization of cell concentration (5–10×10⁶ HUVECs/mL) and flow rates (5 µL/min) to ensure cell viability and uniform encapsulation during printing.
- Requires aseptic handling and sterile filter paper for medium removal during secondary cell seeding to avoid contamination and ensure proper infiltration.
- Limited by the need for post-printing rinsing to remove excess calcium chloride, which adds a manual step that must be standardized across batches.
