Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids
11 августа 2017 г.
Мы предоставляем обобщенных протокол, основанный на стратегии microfluidic подложке для инженерных microfibrous сосудистого русла, где тип средней ячейки можно далее посеяны в интерстициального пространства этой microfibrous структуры для создания васкуляризированной ткани и organoids.
Общая цель данного метода микрофлюидного биопринтинга заключается в создании васкуляризированного тканевого конструкта. Этот метод позволяет решить ключевые вопросы биофабрикации васкуляризированных тканей. Основным преимуществом данной методики является ее универсальность в создании сосудистого русла с контролируемой трехмерной формой для инженерии васкуляризированных тканей посредством вторичного посева клеток.
Хотя данный протокол дает представление о создании васкуляризированных тканей сердца, он также может быть применен ко многим другим типам тканей, таким как печень, кожа и даже опухоли. Специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как настройка биопринтера может быть непростой. Чтобы начать процедуру, сконструируйте двухслойную концентрическую микрофлюидную печатную головку, вставив тупоконечную иглу меньшего размера, выполняющую роль сердечника, в центр более крупной тупоконечной иглы, выполняющей роль оболочки.
Убедитесь, что центральная игла выступает из внешнего кожуха примерно на один миллиметр. После этого вставьте иглу 23 gauge в ствол центральной иглы в противоположном направлении. Сделайте отверстие в боковой стенке ствола внешней иглы и вставьте металлический соединитель соответствующего размера.
Герметизируйте соединение эпоксидным клеем. Установите экструдер на головку биопринтера, используя держатель из полиметилметакрилата (ПММА). Затем, для раздельного впрыска биочернил и сшивающего раствора через две трубки из ПВХ, подключите входные отверстия печатной головки к двухканальному шприцевому насосу.
Приготовьте биочернила, используя смесь альгината, GelMA и фотоинициатора. Растворите их в 25 millimolar HEPES-буфере, содержащем 10% fetal bovine serum или FBS. Затем приготовьте раствор 0.3 molar хлорида кальция в HEPES-буфере с 10% FBS, который будет использоваться в качестве жидкости-носителя для сшивания.
Непосредственно перед биопечатью проведите трипсинизацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) в течение 5–10 минут. Центрифугируйте клетки в 15 мл пробирке при 800 об/мин в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в биочернилах до концентрации от 5×10⁶ до 10×10⁶ клеток/мл, медленно пропипетировав суспензию 5–10 раз.
Затем используйте двухканальный шприцевой насос, чтобы начать подачу биочернил с HUVECs через один канал и сшивающего агента через другой со скоростью потока 5 µL/min. Позвольте потокам течь непрерывно в течение одной минуты до их стабилизации. После этого запустите движение печатающей головки, поддерживая скорость осаждения биопринтера приблизительно 4 mm/s.
Данная биопечать должна привести к быстрой ионной гелации альгинатного компонента и осаждению микроволоконного каркаса. После печати каркаса проведите фотоперекрестное сшивание компонента gelMA с помощью УФ-излучения мощностью от 5 до 10 mW/cm² в течение 20–30 секунд для осуществления химической гелации. Затем удалите избыток хлорида кальция из каркаса, осторожно промыв его теплым PBS при температуре 37 °C.
Культивируйте этот скаффолд в среде для роста эндотелиальных клеток при 37 °C в атмосфере с 5% CO2 в течение периода до 16 дней. Заменяйте среду не реже одного раза в два дня. В процессе культивирования наблюдайте за HUVECs под микроскопом до тех пор, пока они не мигрируют к периферии микроволокон скаффолда и не сформируют просветоподобные структуры.
Затем осторожно удалите всю среду из интерстициального пространства скаффолда с помощью капиллярных сил, используя кусочек стерильной фильтровальной бумаги. Сразу же добавьте каплю суспензии вторичного типа клеток, например кардиомиоцитов, на поверхность скаффолда, позволяя клеткам инфильтрировать все интерстициальное пространство. После этого инкубируйте скаффолд в инкубаторе от 30 минут до двух часов, чтобы клетки прикрепились к отдельным микроволокнам.
Удалите неадгезивные клетки, осторожно промыв скаффолд раствором PBS. Культивируйте данный скаффолд в подходящей среде до образования требуемой васкуляризированной ткани. Описанная здесь микрофлюидная биопечать позволяет осуществлять прямую биопечать микроволоконных скаффолдов с использованием биочернил низкой вязкости.
Каркас размером 6 × 6 × 6 мм³, содержащий более 30 микроволокон, может быть напечатан с помощью биопринтинга в течение 10 минут. Виды сверху и сбоку на микрофотографиях каркаса демонстрируют отличную структурную целостность в процессе биопринтинга. Это было достигнуто за счет немедленного ионного сшивания альгинатного компонента хлоридом кальция.
После микрофлюидной экструзии биочернил, ионного и фотополимеризационного сшивания HUVECs сохраняли относительно высокую жизнеспособность. К 16-му дню клетки пролиферировали и мигрировали от первоначально случайного распределения в нулевой день к периферии микроволокон. Кардиомиоциты новорожденных крыс, высеянные на каркас, созревали и заселяли его.
Они продемонстрировали сильную экспрессию функциональных сердечных биомаркеров, таких как саркомерный alpha-актинин и коннексин 43. Конфокальная микроскопия биопринтингового микроволоконного каркаса, заселенного кардиомиоцитами, выявила совместное присутствие HUVECs и кардиомиоцитов.
HUVECs располагаются преимущественно на границах микроволокон, в то время как кардиомиоциты окружают микроволокна снаружи. Клетки были способны поддерживать спонтанное и синхронное сокращение в течение от 9 до 28 дней, в зависимости от источника клеток и конфигурации скаффолдов.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать васкуляризированные ткани с помощью метода микрофлюидного биопринтинга, а также о способах изготовления печатной головки и принципах работы биопринтера. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как изготовление печатной головки и эксплуатация биопринтера могут вызвать затруднения у людей, которые ранее не использовали подобное оборудование. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости центрирования двух игл в печатной головке и стабилизации потока перед началом биопринтинга.
Благодаря разработке этого метода исследователи в области тканевой инженерии и биофабрикации получили в свое распоряжение еще один эффективный инструмент для создания васкуляризированных тканевых конструктов как для регенерации in vivo, так и для моделирования тканей in vitro.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена методика микрофлюидного биопринтинга, направленная на создание васкуляризированных тканеинженерных конструкций. Этот метод позволяет решать проблемы биофабрикации, обеспечивая создание трехмерного сосудистого русла, которое может быть заселено вторичными типами клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биофабрикация
- Микрофлюидика
- Тканевая инженерия
Теоретические сведения
- Создание васкуляризированных тканей имеет решающее значение для развития органоидов.
- Современные методы сталкиваются с ограничениями при создании сложных тканевых структур.
- Микрофлюидная биопечать предлагает универсальный подход к решению этих проблем.
- Данная методика может быть адаптирована для различных типов тканей, включая ткани сердца, печени и кожи.
Цель исследования
- Разработать протокол создания васкуляризированных тканевых конструктов.
- Углубить понимание методов биофабрикации.
- Создать основу для будущих применений в области тканевой инженерии.
Используемые методы
- Создание двухслойной концентрической микрофлюидной печатной головки.
- Использование более тонкой тупоконечной иглы в качестве сердечника внутри более толстой тупоконечной иглы.
- Посев вторичных типов клеток в микроволокнистую структуру.
- Применение данного метода к различным типам тканей, помимо тканей сердца.
Основные результаты
- Протокол позволяет успешно создать васкуляризированную тканевую конструкцию.
- Продемонстрирована универсальность метода при создании различных типов тканей.
- Получены новые данные о проектировании сложных тканевых структур.
- Определены потенциальные трудности для начинающих специалистов в области биопечати.
Выводы
- Метод микрофлюидного биопринтинга эффективен для создания васкуляризированных тканеинженерных конструкций.
- Данный подход может способствовать прогрессу в исследованиях органоидов.
- Будущие исследования могут расширить область применения этого метода на другие типы тканей и условия.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Микрофлюидная биопечать позволяет создавать васкуляризированные тканевые конструкции с высокой структурной точностью, что устраняет критический барьер в разработке доклинических моделей. Путем формирования перфузируемых микрососудистых сетей внутри гидрогелевых каркасов этот метод обеспечивает создание более физиологически релевантных моделей тканей для скрининга лекарственных препаратов и изучения механизмов их действия. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки, предоставляя настраиваемую платформу для изучения межклеточных взаимодействий, созревания тканей и функциональных ответов в контролируемых условиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимодействия между эндотелиальными клетками и перицитами или стромальными клетками в определенной сосудистой нише для подтверждения терапевтических мишеней, участвующих в ангиогенезе или регуляции сосудистой проницаемости.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимую систему с микрофлюидным контролем для создания васкуляризированных каркасов с однородной архитектурой микроволокон и формированием просвета.
- Прогностическая ценность: позволяет оценивать влияние соединений на целостность сосудов и миграцию клеток в соответствующей человеку трехмерной микросреде (3D).
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет создавать стандартизированные микроволоконные каркасы с инкапсулированными эндотелиальными клетками, которые формируют просветы, подобные сосудистым, что обеспечивает количественную оценку формирования сосудистой сети с течением времени.
- Практическая ценность: совместимость с двухканальным шприцевым насосом для биопечати обеспечивает точный контроль подачи биочернил и сшивающего раствора для высокопроизводительного изготовления каркасов.
- Готовность анализа: позволяет получать каркасы с количеством микроволокон >30 в объеме 6x6x6 мм в течение 10 минут, что обеспечивает масштабируемую подготовку для последующего посева вторичных клеток и скрининга соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает возможность вторичного посева кардиомиоцитов или других паренхимальных клеток в интерстициальное пространство, что облегчает изучение созревания васкуляризированной ткани и синхронизированной сократительной функции.
- Трансляционная преемственность: поддерживает долгосрочное культивирование (>16 дней) с мониторингом миграции клеток, формирования просвета и экспрессии биомаркеров (например, саркомерного альфа-актинина, коннексина 43) для моделирования реакций на уровне ткани.
- Снижение рисков: позволяет оценивать жизнеспособность, пролиферацию и функциональное созревание клеток в условиях, имитирующих перфузию, что снижает потери из-за плохого приживления сосудов на более поздних этапах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации ведущего соединения, предоставляя васкуляризированную платформу, которая служит связующим звеном между простыми монокультурами и сложными моделями in vivo.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о сосудисто-зависимых путях за счет обеспечения контролируемого совместного культивирования эндотелиальных и паренхимальных клеток в заданной 3D-геометрии.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу каркасы с воспроизводимой микроструктурой и эндотелизацией, пригодные для оценки воздействия соединений на стабильность сосудов и организацию тканей.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные с помощью конфокальной микроскопии распределения клеток, формирования просвета и колокализации биомаркеров для оценки качества и функционального созревания тканей.
- Трансляционные исследования: моделирует развитие васкуляризированной ткани — от раннего формирования эндотелиальной сети до интеграции вторичных клеток, что поддерживает доклиническую валидацию кандидатов для таргетной сосудистой или регенеративной терапии.
- Корпоративное повторное использование: конструкция микрофлюидного печатного узла и система биочернил (GelMA-альгинат с ионным/фотосшиванием) представляют собой универсальную платформу, адаптируемую для различных типов тканей (сердца, печени, кожи) и вторичных типов клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов за счет создания васкуляризированных тканей с перфузируемыми люменоподобными структурами и стабильной функцией клеток (например, синхронным сокращением до 28 дней).
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию изготовления скаффолдов с помощью микрофлюидного контроля потока, что снижает вариативность диаметра микроволокон, эффективности сшивания и распределения клеток.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя ранние данные о совместимости сосудов и реакциях на уровне тканей, что снижает вероятность неудач на поздних этапах из-за недостаточной васкуляризации.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе их воздействия в релевантной для человека модели васкуляризированной ткани, которая воспроизводит ключевые структурные и функциональные характеристики.
Особенности реализации
- Требуется опыт изготовления микрофлюидных устройств, включая сборку концентрических игл и герметизацию эпоксидным компаундом для предотвращения утечек.
- Зависимость от двухканальных систем шприцевых насосов и оборудования для УФ-фотосшивки для точного подачи биочернил и стабилизации GelMA.
- Необходима оптимизация концентрации клеток (5–10×10⁶ HUVECs/mL) и скорости потока (5 µL/min) для обеспечения жизнеспособности клеток и равномерного инкапсулирования в процессе печати.
- Требуется соблюдение правил асептики и использование стерильной фильтровальной бумаги для удаления среды при вторичном посеве клеток, чтобы избежать контаминации и обеспечить надлежащую инфильтрацию.
- Ограничение, связанное с необходимостью промывки после печати для удаления избытка хлорида кальция, что добавляет ручной этап, который должен быть стандартизирован для всех партий.
