Метод для характеризующие эмбриогенеза в проростках Arabidopsis

Общая цель данного метода состоит в том, чтобы охарактеризовать формирование паттернов эмбрионов в процессе эмбриогенеза растений с использованием модельного организма. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области растительного вещества, такие как эмбриогенез у Arabidopsis. Основное преимущество данной методики заключается в том, что формирование рисунка эмбриона у модельного растения Arabidopsis можно охарактеризовать рекомендованной операцией.

Эту процедуру демонстрирует Цзиньлин Фэн, аспирант из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, добавьте 100 семян в 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте один миллилитр гипохлорита натрия для стерилизации семян.

Переверните трубку несколько раз, чтобы убедиться, что семена и раствор хорошо перемешались. Через пять минут центрифугируйте пробирку при давлении 1200 G в течение 30 секунд. Удалите надосадочную жидкость и четыре раза промойте семена стерильной водой, чтобы удалить остатки гипохлорита натрия.

Далее добавьте 4,4 грамма смеси базальной соли MS и 10 грамм сахарозы на один литр ультрачистой воды. Перемешайте, чтобы соль и сахароза растворились. Используя гидроксид калия в концентрации один моль, отрегулируйте pH раствора до 5,8.

Затем добавьте три грамма желирующего вещества и стерилизуйте раствор при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. Высыпьте 30 миллилитров полученной среды МС в 12-сантиметровую посуду для культуры. Выложите стерилизованные семена на тарелку МС.

Перенесите тарелку в холодильник и подержите ее при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в течение трех дней, чтобы стратифицировать семена. Далее держите пластину в камере роста в условиях длинного дня в течение восьми дней. Затем переложите растения в почву в поддон.

Накройте противень прозрачной белой крышкой, чтобы предотвратить потерю воды. Оставляя небольшой зазор, чтобы избежать остеклования растений. Через пять дней снимите крышку и выращивайте растения в камере для проходных в условиях долгого дня.

Примерно через 20 дней роста с помощью нити отметьте от 10 до 15 цветочных почек на месте стеблей семян и соцветия в 20:00. Определите начало опыления семяпочки, когда отмеченные бутоны раскроются для цветения, как 8:00 утра следующего дня. Чтобы начать приготовление раствора Хойера, добавьте 24 грамма хлоргидрата в 50-миллилитровую пробирку. Полностью оберните трубку алюминиевой фольгой, убедившись, что фольга герметизирует весь свет.

Добавьте девять миллилитров ультрачистой воды и три миллилитра глицерина. Встряхните трубку, чтобы растворить хлоргидрат. Затем дайте приготовленному раствору Хойера постоять ночь при комнатной температуре, чтобы устранить любые пузырьки.

Для начала прикрепите кусок двустороннего скотча к предметному стеклу микроскопа. Размещайте силик, выращенный в течение нужного количества дней после опыления, на стороне с перпендикулярной поверхности псевдоперегородкой. С помощью иглы шприца расщепите запястья с обеих сторон псевдоперегородки.

Далее прикрепите два рассеченных запястья к предметному стеклу так, чтобы семяпочки и силик были видны под стереоскопом. Нанесите 70 микролитров раствора Хойера на предметное стекло. Затем окуните в раствор пинцет с тонким кончиком, чтобы смочить кончик.

С помощью стереоскопа и пинцета переместите семяпочки в раствор Хойера для очистки эмбрионов. После этого аккуратно приложите к предметному стеклу защитный листок, следя за тем, чтобы не образовались пузыри. Готовую горку помещаем в коробку в темное помещение на срок от двух до 12 часов при комнатной температуре.

По прошествии необходимого времени используйте функцию DIC микроскопа для осмотра очищенных семяпочек. Расположите эмбрионы под маломощным полем, а затем переключитесь на высокомощное поле, чтобы наблюдать за клеточным паттерном в развитых эмбрионах. Затем исследуйте эмбрионы на разных стадиях развития.

Для начала приготовьте плазмиду DR5 GFP и введите ее в растения дикого типа с помощью трансформации, опосредованной агробактериями в метассианы, как указано в текстовом протоколе. Выберите установки Т1 с использованием средних планшетов MS, содержащих гидролизин. Затем перенесите и культивируйте растения, как указано в текстовом протоколе, чтобы получить растения T3.

С помощью нитки отметьте цветочные бутоны гомозиготного растения Т3 в положении стеблей семян у соцветия в 20:00. После этого смешайте три миллилитра глицерина с 47 миллилитрами ультрачистой воды, чтобы получить 6% раствор глицерина. Затем приложите кусочек двустороннего скотча к предметному стеклу микроскопа. Поместите силик растения Т3 на предметное стекло так, чтобы псевдосептум был перпендикулярен поверхности.

С помощью иглы шприца расщепите запястья с обеих сторон псевдоперегородки. Приложите два рассеченных запястья к предметному стеклу так, чтобы семяпочки и силик были видны под стереоскопом. Затем нанесите на предметное стекло 30 микролитров 6% глицерина.

Опустите в раствор пинцет с тонким кончиком, чтобы смочить кончик. С помощью стереоскопа и пинцета переместите семяпочки в раствор глицерина. Аккуратно наденьте на предметное стекло защитный листок.

Затем быстро и осторожно постучите по предметному стеклу, чтобы выдавить эмбрион из яйцеклетки. После этого с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследуют предметное стекло на предмет флуоресценции зеленого флуоресцентного белка. Найдите изолированные эмбрионы под маломощным полем и запишите их местоположение.

Переключитесь на мощное поле и установите возбуждающий источник света на 488 нанометров, чтобы наблюдать за экспрессией GR5 GFP в эмбрионах. Затем определите экспрессию GFP и охарактеризуйте формирование паттерна эмбриона, как описано в текстовом протоколе. В этом исследовании эмбриогенез у Arabidopsis наблюдается через клиренс семяпочек, как можно видеть.

После клиренса семяпочек эмбрионы на разных стадиях развития различимы с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии. Затем характер экспрессии GR5 GFP во время эмбриогенеза регистрируется с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Видно, что DR5 экспрессируется в полюсе корня шаровидных и сердцевидных эмбрионов дикого типа.

DR5 экспрессируется в кончиках семядолей эмбриона и в сосудистой сети зрелых эмбрионов дикого типа. После этого изучается роль naa10 у Arabidopsis во время эмбриогенеза. Гипотеза была обнаружена аномально разделенной, с косым и вертикальным делением у naa10 по сравнению с поперечным асимметричным делением у растений дикого типа.

Как видно здесь, быки имеют почти равномерное распределение у большинства эмбрионов naa10 на шаровой стадии и сохраняют более широкий сигнал в гипотезах по сравнению с эмбрионами дикого типа. Эти результаты указывают на то, что naa10 необходим для эмбриогенеза, и что он может быть вызван через сигнальный путь быков у Arabidopsis. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, как выращивать арабидопсис в качестве растительного материала.

После этой процедуры могут быть выполнены другие меры, такие как гибридизация in situ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как экспрессия генов, специфичных для клеток. После своего развития этот метод открывает исследователям в области эмбриогенеза путь к изучению молекулярного механизма, с помощью которого конкретные гены опосредуют эмбриогенез у арабидопсиса. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как охарактеризовать эмбриогенез у арабидопсиса.