3D Microtissues для инъекций восстановительной терапии и высок объём наркотиков скрининг

Общая цель изготовления эластичных 3D макропористых микрокриогелей с использованием криогелирования заключается в облегчении инъекционной регенеративной терапии и высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов in vitro. В этом видео представлены протоколы изготовления универсальных 3D-микротканей и их применения в регенеративной терапии и скрининге лекарств. Метод регенеративной терапии улучшает удержание стволовых клеток, выживаемость и терапевтические функции после инъекции в область раны.

Скрининг на наркотики также улучшен из-за простоты использования и потенциала для высокопроизводительного скрининга. Как правило, люди, не знакомые с 3D-культурой, испытывают трудности из-за сложных протоколов. Этот метод упрощает 3D-культуру и предлагает исследователям больший контроль над полученными 3D-микротканями.

Помогать в демонстрации этих процедур будут Чжоу Лю, Лю Вэй, Ли Яцянь и Ю Чжифэн, четыре аспиранта нашей лаборатории. Промойте микротрафаретную матрицу из ПММА деионизированной водой, чтобы удалить мусор, оставшийся от лазерной гравировки. Затем высушите микротрафаретную матрицу при температуре 60 градусов Цельсия.

Далее обработайте высушенную стружку в плазмочистителе группами по четыре штуки. Сначала запустите вакуумный насос в течение двух минут. Затем используйте 18 Вт радиочастотной мощности в течение трех минут, чтобы увеличить гидрофильность чипов.

Теперь сделайте один миллилитр раствора прекурсора желатина на каждые пять чипов. Растворите желатин на водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия и выдержите раствор на льду в течение пяти минут. После легкого охлаждения, но все еще жидкого состояния, тщательно перемешайте глутаральдегид с раствором предшественника желатина до конечной концентрации 0,3% глутарового альдегида.

Теперь нанесите пипеткой 200 микролитров приготовленного раствора на верхнюю поверхность каждого чипа. Равномерно распределите раствор по стружке с помощью изогнутого стеклянного стержня. Далее немедленно перенесите загруженные раствором чипы матрицы в морозильную камеру с температурой минус 20 градусов Цельсия на 16 часов для криогелирования.

На следующий день охладите лиофилизатор до минус 40 градусов Цельсия в течение примерно 30 минут. Затем загрузите микросхемы массива и лиофилизируйте их в течение двух часов под вакуумом. В этих условиях лед станет сублимированным, и тогда стружка будет готова к использованию.

Начните со сбора отдельных микрокриогелей из чипсов. Начните с наложения изготовленной микрокриогенной матрицы на изготовленную матрицу эжекторных контактов PDMS. Выровняйте каждый микрокриогель с помощью эжекторного штифта.

Затем вдавите микрокриогельный чип в массив, чтобы вытеснить микрокриогели из их лунок. Теперь соберите выброшенные микрокриогели в водяную баню и соберите их с помощью клеточного фильтра. Используйте одно ситечко, чтобы собрать все микрокриогели с одного чипа.

Далее промойте микрокриогели боргидридом натрия на льду. Дайте остаткам несшитого альдегида погаситься в течение примерно 20 минут. Затем выбросьте боргидрид натрия и промойте микрокриогели пятью миллилитрами деионизированной воды в течение 15 минут.

Прежде чем продолжить, выполните в общей сложности от трех до пяти промываний водой. После удаления микрокриогелей из последней промывки водой с помощью пинцета перенесите их из сетчатого фильтра в 35-миллиметровую чашку Петри. Каждая коллекция микрокриогелей составляет один кластер.

Теперь добавьте от 50 до 70 микролитров деионизированной воды в каждый кластер микрокриогелей и накройте тарелку крышкой. Затем осторожно постучите по тарелке, чтобы разровнять все сложенные микрокриогели. Затем заморозьте микрокриогели при температуре минус 20 градусов Цельсия на четыре-16 часов.

Позже лиофилизируйте их в течение двух часов, как и раньше. Следующим шагом будет создание 3D микротканей. Сначала простерилизуйте микрокриогели.

Затем соберите клетки с трипсином, количественно оцените их плотность и ресуспендируйте их в концентрации восемь миллионов клеток на миллилитр в питательной среде. Далее пипеткой нанесите 60 микролитров клеточной суспензии на каждый кластер микрокриогелей. Держите посуду во влажной камере и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы клетки впитались в гели.

После инкубации добавьте по два миллилитра питательной среды в каждую посуду, и продолжайте культивирование, меняя среду через день. Через два дня сформируются 3D-микроткани. Чтобы ввести 3D-микроткани мыши, сначала перенесите их в пятимиллилитровую пипетку, а затем загрузите в сетчатое фильтр для фильтрации питательной среды.

Затем ресуспендируйте 3D-микроткани в 15% растворе желатина. После подготовки животного к имплантации внутримышечно введите микроткани в три места грацилисной мышцы. Каждая инъекция должна содержать 150 микрокриогелей в 150 микролитрах раствора.

Используйте одномиллилитровый шприц с иглой 23 калибра. После сборки микрокриогенного массива для культивирования клеток на кристалле осторожно поместите их в предварительно нагретую влажностную камеру, чтобы они не намокли. Затем тщательно нанесите три микролитра тщательно перемешанной клеточной суспензии непосредственно на каждую микрокриогенную лунку.

Перед тем, как вытолкнуть раствор, дайте наконечнику пипетки слегка коснуться поверхности микрокриогеля. Не засевайте периферийные лунки. После загрузки лунок добавьте по 10 микролитров селективной среды в каждую лунку, и добавьте среду в периферийные лунки для замедления испарения с помощью 96-канального дозатора жидкости.

Затем культивируйте чипы в камере влажности в течение 24 часов для формирования 3D-микротканей. На следующий день с помощью 96-канального дозатора жидкости добавьте по 10 микролитров лекарств в каждую лунку с градиентом концентрации четыре раза, чтобы завершить добавление всех 384 лунок, включая контроль ДМСО. Затем продолжайте культивирование в течение 24 часов.

После 24 часов лечения препаратом добавьте четыре микролитра исходного раствора резазурина в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение двух часов, позволяя клеткам метаболизировать резазурин. Чтобы оценить метаболизм резазурина в клетках, используйте планшетный ридер. Собранные желатиновые микрокриогели имели заранее определенные формы и размеры.

Анализ, проведенный методом SEM, показал, что микрокриогели содержали взаимосвязанные макропористые структуры с размерами пор в диапазоне от 30 до 80 микрон. Инъекционную способность желатиновых микрокриогелей количественно оценивали путем их культивирования после инъекции. 1000 на миллилитр вводились с концентрацией на 6 ньютонов меньше клинически приемлемой силы в 10 ньютонов.

Стволовые клетки в микрокриогелях сохраняли высокую жизнеспособность и большую пролиферативную способность после введения в течение пяти дней культивирования. С использованием таких клеток была проведена терапевтическая обработка модели ишемии конечностей мыши, а физиологическое состояние ишемизированных конечностей было изучено через 28 дней после операции. Лечение микротканей 100 000 стволовыми клетками улучшило сохранение конечностей.

Только у 25% мышей наблюдалась спонтанная ампутация пальцев ног через 28 дней. В другом приложении 3D-матрица микротканей использовалась для высокопроизводительного тестирования лекарств. Клетки гепатоцеллюлярной карциномы лечили доксорубицином, а клетки немелкоклеточного рака легкого — IMMLG-8439.

В обоих случаях лекарственная устойчивость была увеличена с помощью 3D-культивирования. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготавливать эластичные 3D микропористые микрокриогели для 3D-культуры вне чипа с использованием инъекционной регенеративной терапии или массивы 3D клеточных культур на чипе для высокопроизводительного скрининга лекарств in vitro. Этот метод проложил путь исследователям в области клеточной регенеративной терапии и скрининга лекарств, чтобы использовать 3D-культивирование клеток, тем самым продвигая обе области исследований.

Не забывайте, что работа с глутаральдегидом и боргидридом натрия может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащей защитной одежды и работа под лабораторным колпаком.