Жить клеточной изображений грибковых клеток расследовать режимы записи и внутриклеточных локализации дефензинов противогрибковые завод

Завод дефензинов играть важную роль в защите растений против патогенов. Для эффективного использования этих противогрибковые пептидов как противогрибковых агентов, понимая их режимы действий (MOA) имеет решающее значение. Здесь жить клеточной изображений метод описан для изучения важнейших аспектов MOA этих пептидов.

Общая цель этого метода визуализации живых клеток заключается в изучении критических аспектов механизмов действия противогрибковых растительных дефензинов в клетках грибов. С появлением передовых методов конфокальной микроскопии визуализация живых клеток стала мощным инструментом для изучения механизмов действия противогрибковых защит растений. Используя эту технологию, мы представляем метод, который поможет ответить на ключевой вопрос в понимании механизмов действия противогрибковых защитных средств растений.

Наше внимание сосредоточено на том, как эти пептиды интернализуются в клетках гриба и как эти пептиды локализуются в клеточных органеллах или диффундируют в цитоплазме. Для приготовления конидиальной суспензии штамма PH-1 Fusarium graminearum сначала устанавливают культуры штамма на планшеты, содержащие полноценную среду. Культивируйте их при температуре 28 градусов Цельсия в течение пяти дней.

Для получения конидий необходимо ввести четыре пробки пятидневной культуры диаметром 10 миллиметров в 50 миллилитров среды карбоксиметилцеллюлозы. Культивируйте эти пробки в течение четырех-семи дней при температуре 28 градусов Цельсия на ротационном шейкере, установленном на 180 оборотов в минуту. Когда культуры имеют красный цвет, конидии уже сформировались.

Чтобы собрать конидии в виде суспензии, наведите жидкую культуру в вихревой кон и отфильтруйте один ее миллилитр через два слоя фильтрующего материала в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте суспензию в течение двух минут, а надосадочную жидкость выбросьте. Затем промойте гранулу одним миллилитром стерильной воды, и повторите центрифугирование.

Далее суспендируйте гранулу в одном миллилитре 2x SFM. Затем подсчитайте конидии с помощью гемоцитометра, и отрегулируйте плотность суспензии до 100 000 конидий на миллилитр. Чтобы получить конидиальную суспензию Neurospora crassa, перенесите конидии из исходных культур в наклонную трубку, содержащую агаровую среду Фогеля, и инкубируйте пробирки при комнатной температуре при постоянном освещении в течение пяти дней.

Через пять дней перенесите небольшое количество растущей культуры с помощью петли инокуляции в микроцентрифужную пробирку, содержащую два миллилитра жидкой среды Фогеля. Обязательно перемешивайте конидии вне петли. Затем отфильтруйте суспензию, центрифугируйте ее и повторно суспендируйте гранулы конидии в среде Фогеля без этапа промывки.

Наконец, отрегулируйте окончательную суспензию до 100 000 конидий на миллилитр. Чтобы сделать препарат для конфокальной микроскопии, нанесите пипеткой 50 микролитров суспензии конидий на 35-миллиметровую чашку для культивирования и дайте конидии прорасти в течение трех-шести часов при комнатной температуре. Для конфокальной микроскопии пипетку ввели 50 микролитров конидиальной суспензии в 10-миллиметровую микролунку чашки со стеклянным дном.

Затем при заданной минимальной ингибирующей концентрации добавить в суспензию 50 микролитров флуоресцентно меченых дефензинов и инкубировать конидии с мечеными дефензинами в течение 2,5 часов при комнатной температуре. После инкубации добавьте два микролитра мембранного селективного красителя FM4-64, для конечной концентрации пять микромоляров. Затем инкубируйте культуру в течение 30 минут при комнатной температуре перед осмотром конидий.

Чтобы настроить конфокальный микроскоп, выберите лазер белого света. Используйте 488-нанометровые и 550-нанометровые лазеры для возбуждения меченых родамином дефензинов и красителя FM4-64 соответственно. Установите эти лазеры на интенсивность 1%Затем установите длину волны обнаружения на 580–700 нанометров для меченного родамином дефензина и от 690 до 800 нанометров для красителя FM4-64.

Теперь соберем изображения. Для покадровой визуализации добавьте 50 микролитров конидиальной суспензии в чашку для микролунок со стеклянным дном. Затем установите микролуночную чашку на микроскоп и найдите ячейки с низким энергопотреблением.

Затем переключитесь на 100x, 1.44 масляный объектив. Чтобы наблюдать меченые DyLight550 дефензины, установите лазерную линию на 550 нанометров для возбуждения и от 560 до 600 нанометров для обнаружения. Далее установите режим сканирования на xyzt.

Затем установите Z-положение, зум, частоту захвата изображения и так далее, по мере необходимости. Теперь к конидиальной суспензии добавьте 50 микролитров меченых флуорофорами дефензинов в минимальной ингибирующей концентрации в три микромоляра и добавьте два микролитра мембранного селективного красителя FM4-64 для получения конечной концентрации в пять микромоляров. Затем при необходимости перефокусируйте оптику.

Перед съемкой поместите небольшие кусочки влажной фильтровальной бумаги в чашку для микролунок, чтобы предотвратить испарение. Затем обрабатывайте процесс со съемкой изображения каждые 3,5 минуты в течение 2,5 часов. Визуализация живых клеток была проведена для отслеживания и сравнения интернализации и субклеточной локализации двух дефензинов из Medicago truncatula.

Химически синтезированный меченый родамином дефензин 4 по-разному продавался у Neurospora crassa и Fusarium graminearum. FM4-64 мечет плазматические мембраны обоих грибов. Однако при фузариозе дефензин 4 диффундирует в цитоплазме.

В то время как при Neurospora он транспортируется к везикулярным телам. Для сравнения, дефензин 5 визуализировали с помощью метки DyLight550 у Neurospora crassa, наряду с мечением плазматической мембраны FM4-64. Покадровая визуализация показывает, что этот дефензин проникает в клетки в течение 30-40 минут, а затем диффундирует через цитоплазму.

Это отличается от трафика дефензина 4, который проникает в клетки и остается в ловушке внутри везикулярных тел даже через три часа. Таким образом, визуализация живых клеток является мощным инструментом для улучшения нашего понимания способов действия противогрибковых различий растений. Вместе с другими жизненно важными флуоресцентными красителями и клеточными маркерами он обладает гибкостью, позволяющей модифицироваться для других антимикробных пептидов.

В конечном счете, этот метод может помочь разработать новые стратегии использования антимикробных пептидов в качестве противогрибкового агента в сельском хозяйстве и медицине.