Количественные локализация белка Гольджи изображения его масса центр флуоресценции

Общая цель этого метода, основанного на визуализации, — количественно локализовать белок Гольджи с нанометровым разрешением. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы при изучении аппарата Гольджи, такие как организация Гольджи и его работа. Главное преимущество этого метода — использование обычного светового микроскопа и программного обеспечения.

Для начала культивируйте клетки HeLa в термофляже T25 в DMEM с добавлением 10% FBS и инкубуйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Когда клетки достигают примерно 80%, аспирируйте культурную среду и добавьте в колбу один миллилитр 25%трипсин ЭДТА. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в течение двух минут.

Выньте клетки из инкубатора и добавьте один миллилитр полной среды, чтобы аккуратно промыть клетки со стенки колбы. Перенесите отсоединённые клетки в стерильную центрифугационную трубку и вращайте трубку при давлении 500 г в течение двух минут, чтобы пеллетировать клетки. После аспирации супернатанта используйте один миллилитр полной среды, чтобы подвесить клеточную гранулу.

Выньте среду из колодца пластины на 24 лунки, содержащей стерилизованную стеклянную крышку, и засейте примерно 100 000 клеток в колодцу. Используйте полный медиум, чтобы увеличить объём колодца до 5 миллилитров. Затем инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.

Когда клетки достигнут 80% совпадения, используйте 80 нанограммов GalT-mCherry и 320 нанограммов плазмидной ДНК TPST1-EGFP и реагента трансфекции для трансфекции клеток согласно протоколу производителя. После инкубации клеток в течение четырёх-шести часов измените среду и верните клетки в инкубатор на 12 часов. Аспирируйте среду в колодце и добавьте 5 миллилитров 33 микроформы нокодазола, содержащего полную среду, затем инкубируете клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение трёх часов.

После очистки стеклянных покрытий согласно текстовому протоколу используйте однократный PBS, содержащий 1 микрограмм на микролитр BSA, чтобы разбавить 110 нанометров многоцветные флуоресцентные шарики в 80 раз. Кратковременно закрутите трубку, чтобы рассеять заполнения шариков. С помощью наконечника пипетки нанесите 60 микролитров разбавленных шариков на чистую крышку.

В темноте положите крышку в 35-миллиметровую чашу и накройте её алюминиевой фольгой. Высушите крышку в темноте в десикаторе, подключённом к вакуумному насосу. Затем используйте 50 микролитров монтажного материала, чтобы закрепить крышку на стеклянном затворе.

Правильно чистая крышка необходима для удаления люминесцентного мусора. Чтобы сфотографировать многоцветные шарики в зелёном, красном и дальнем красном каналах, в начале сессии съёмки сделайте 3D-стопки изображений, сделав три участка выше и ниже лучшей фокальной плоскости. Сохраняйте стеки как TIFF-файлы.

Для изображения мини-стеков Гольджи используйте TPST1-EGFP и GalT-mCherry, трансфектируемые в флуоресцентно маркированных слайдах, чтобы найти клетки, экспрессирующие TPST1-EGFP и низкий или средний уровень GalT-mCherry. Получите стеки 3D-изображений, как уже показано. Чтобы проанализировать изображения, откройте изображение J, выберите File, Image, Open, чтобы открыть набор изображений бусин, состоящих из трёх TIFF-файлов.

Выберите Image, Stacks, Z Project, чтобы усреднить три последовательных секции вокруг лучшего фокуса в красном канале. Введите номер секции стартового и стоп-среза, а среди вариантов типа проекции выберите среднюю интенсивность. Рисуйте фоновые ROI без бусинок на изображении.

Затем в разделе Анализ, Набор измерений ставьте галочку только на среднее значение серого и Стандартное отклонение или SD. Выполните анализ, измеряйте, чтобы получить фоновую среднюю интенсивность и стандартное отклонение. Выберите Процесс, Математика, Вычитание, чтобы вычесть изображение с соответствующими значениями средней интенсивности фона плюс шесть раз стандартного отклонения. Затем введите рассчитанное значение, соответствующее этому каналу.

Повторите усреднение и вычитание для стеков изображений зелёного и дальнего красного каналов, используя тот же стартовый и стоп-срез и тот же фоновый ROI. Объедините три обработанных изображения с помощью каналов Изображение, Цвет, Объединение, выбрав канал R как красный, канал G как зелёный, канал B как синий. Запустите менеджер ROI, выбрав Анализ, Инструменты, Менеджер ROI.

Нарисуйте квадратные ROI вокруг отдельных бусин. Затем добавьте ROI в ROI Manager, нажав T на клавиатуре. В разделе «Анализировать», «Задать измерения» проверьте только центр массы.

В ROI Manager выберите канал R и нажмите Измерить, чтобы получить координаты X и Y центров ROI в окне результатов. Скопируйте и вставьте две колонки в таблицу. Получите координаты центров ROI для каналов G и канала B. Сохраните таблицу как beads.csv.

В изображении J используйте плагины для установки двух макросов, макро Golgi ROI инспекции и макро-вывода данных по трёх каналам. Очистите менеджер ROI и окно результатов. Откройте набор мини-стеков Гольджи, состоящих из трёх TIFF-файлов.

Сгенерируйте вычитанные фоновые изображения, как показано ранее в этом видео, для последующего использования. Затем дублируйте изображения. В разделе «Процесс, калькулятор изображения» добавьте фоновые изображения канала G, канала R и канала B.

К полученному изображению в разделах Image, Adjust, Threshold выберите Set to input one как минимальный пороговый уровень. В разделе «Анализировать, анализировать частицы» введите диапазон размеров для пикселя размера. Введите 50 в бесконечность, проверьте «исключённые» на рёбрах и добавьте в менеджер.

Далее используйте Image, Color, Merge Channels, чтобы объединить три ранее выченные фоновые изображения, выбрав канал R как красный, канал G как зелёный и канал B как синий. Затем проведите проверку ROI макро Golgi, выбрав Plugins, Macro, Golgi ROI Inspection. Важно выбрать как можно больше ROI, содержащих отдельные мини-стеки Гольджи в наборе изображений.

В разделе «Анализ, задай измерения» проверьте только площадь, среднее значение серого и центр масс. Получите данные, запустив макро-инструмент для макро вывода данных на три канала. Скопируйте координаты центров в таблицу в порядке, указанном здесь.

Затем сохраняйте таблицу как ministacks.csv. Переходите к хроматической коррекции сдвига центров и вычислению коэффициента локализации или LQ согласно текстовому протоколу. Современный световой микроскоп исследовательского класса, оснащённый простой апохроматической линзой, как здесь, демонстрирует минимальное хроматическое смещение.

Однако внимательное изучение многоцветного изображения бусины показывает это. Центры красной флуоресценции определяются как истинные положения бусин. Относительные хроматические сдвиги зелёного и дальнего красного флуоресценции можно представить векторами.

Хроматический сдвиг внутри плоскости изображения иллюстрируется зелёным и синим вектором для каждой шарикинки. Как показано здесь, коррекция хроматического смещения значительно уменьшает хроматический сдвиг. В клетках млекопитающих комплекс Гольджи агрегируется в перинуклеарной области, которая обычно не поддаётся разрешения под обычным оптическим микроскопом.

После обработки нокодазолом перинуклеарный комплекс Гольджи исчезает, и десятки мини-стеков Гольджи собираются в местах выхода эндоплазматического ретикулума по всей цитоплазме. Пример изображения, созданный с помощью анализа изображения, показанный в этом видео, показан здесь. С помощью инструмента проверки ROI Macro Golgi было перечислено 40 выбранных мини-стеков Golgi.

После применения трёх критериев было проанализировано 21 мини-стек Гольджи для расчёта LQ TPST1-EGFP. После освоения эту технику можно выполнить за один час после флуоресцентной маркировки. После разработки этот метод открыл путь для исследователей, изучающих аппарат Гольджи, количественно локализовать белок Гольджи с разрешением, эквивалентным иммуноэлектронной микроскопии.