Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM

Общая цель данного протокола визуализации заключается в отображении нескольких белков в активированном Т-лимфоците с помощью микроскопии локализации одиночных молекул. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области активации Т-клеток, такие как распределение отдельных молекул TCR или компонентов микрокластеров. Основным преимуществом данной методики является то, что она обеспечивает более высокий уровень мультиплексирования, чем современные методы микроскопии с контролируемым разрешением.

Для начала проведите прямое конъюгирование антител с красителем Alexa 647, используя набор для маркировки антител Alexa 647 в соответствии с протоколом маркировки, предоставленным производителем. Центрифугируйте маркированные антитела в течение пяти минут при 20 800 ×g. После центрифугирования соберите супернатант, чтобы удалить агрегированные антитела. Затем обработайте камеры со стеклами A12 250 µL 0,1% поли-L-лизина в течение 15 минут.

Затем аспирируйте раствор без промывки и высушите камеры при 65 °C в течение 30 минут. Приготовьте разведение флуоресцентных наноалмазов (FNDs) размером 100 nm в одном PBS; протестируйте различные варианты разведения, чтобы убедиться, что в каждом поле зрения будет видно достаточное количество FNDs. Перемешайте разведенные FNDs на вортексе в течение одной минуты.

Затем подвергните супернатант FND воздействию ультразвука в течение 30 секунд при высоких настройках мощности. Инкубируйте обработанный ультразвуком супернатант FND в камере с покровным стеклом A12, покрытым поли-L-лизином, в течение 30 минут при комнатной температуре. После пятикратной промывки камеры 1x PBS визуализируйте камеру с нанесенным FND, используя лазерное возбуждение с длиной волны 647 нанометров на микроскопе turf.

Используйте объектив с увеличением 100x, обеспечивающий поле зрения размером 61 на 61 микрон. При соответствующем разведении FND в поле зрения в идеале должно быть видно от 4 до 10 отдельных FND, при этом по крайней мере один FND должен находиться в каждом квадранте области визуализации. После достижения надлежащей плотности FND добавьте в каждую лунку 250 microliters антител к CD3.

Инкубируйте камеру в течение одного часа при 37 °C или в течение ночи при 4 °C. После инкубации удалите раствор из лунок и добавьте 1x PBS на 30 секунд. Повторите этот этап промывки пять раз.

Центрифугируйте один миллилитр T-клеток Jurkat при 800 ×g в течение шести минут. В идеале концентрация T-клеток Jurkat перед центрифугированием должна составлять от 0,5 до одного миллиона клеток на миллилитр. Ресуспендируйте клетки в 300 µL 1x раствора HBS.

Тем временем добавьте по 150 µL 1x раствора HBS в каждую лунку камеры и инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут. Затем добавьте по 50 µL ресуспендированных T-клеток Jurkat в каждую лунку и инкубируйте в течение трех минут при 37 °C. Далее добавьте по 300 µL 4% параформальдегида в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.

После трехкратной промывки 1x PBS пермеабилизуйте клетки, добавив 250 microliters 0,1% раствора Triton x на пять минут при комнатной температуре. После еще трех промывок 1x PBS добавьте в каждую лунку 250 microliters 1% раствора рыбьего желатина на 30 минут при комнатной температуре. В завершение промойте клетки еще три раза 1x PBS.

Добавьте 200 µL меченого антитела в концентрации от 0,1 до 0,5 µg/mL к фиксированным клеткам и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. После пятикратной промывки клеток 1x PBS добавьте 1 mL буфера STORM и накройте камеру стеклянным покровным стеклом для ограничения воздействия внешней среды. Используйте зажимы на предметном столике микроскопа, чтобы зафиксировать камеру с покровным стеклом в нужном положении.

Этот этап имеет решающее значение для широкомасштабного мультиплексирования, так как одна и та же область обзора должна сохраняться после нескольких циклов промывки и инкубации. Используя низкую мощность лазера 647 нанометров в режиме turf, найдите в поле зрения окрашенную клетку, содержащую не менее трех FND. Увеличьте мощность лазера 647 нанометров и получите изображения.

Типичные параметры приведены в текстовом протоколе. Промойте клетки пять раз 1x трис-солевым буфером или 1x TBS. Затем добавьте один миллилитр элюирующего буфера и инкубируйте при комнатной температуре в течение одной минуты.

Повторите элюцию три раза. Используйте точно указанные условия элюции и количество промывок, необходимых для удаления сигнала, согласно спецификации для каждого антитела. Затем трижды промойте клетки 1x TBS и добавьте один миллилитр 1x PBS.

Правильное выполнение этого этапа элюции приведет к удалению ранее связавшихся антител и обеспечит более высокую эффективность последующего мечения антител. Для промывок важно использовать TBS, чтобы минимизировать выпадение осадка между этапами элюции. Проведите фотообесцвечивание клеток с помощью лазера с длиной волны 647 нм на высокой мощности, используя лазер с длиной волны 405 нм при мощности от 2 до 5 мВт для фотоактивации красителей Alexa 647, находящихся в темном состоянии.

Дождитесь полного фотообесцвечивания остаточного сигнала от неэлюированных антител. Обычно для этого требуется от двух до пяти секунд лазерного облучения. Сделайте контрольные снимки образца, используя настройки STORM после элюции и фотообесцвечивания, чтобы подтвердить отсутствие сигнала.

Затем добавьте 250 µL 4% параформальдегида на 15 минут. Это предотвращает обратное сшивание фиксированных молекул в клетке. Промойте клетки трижды 1x PBS.

Повторите эти шаги для последовательного мечения нескольких мишеней. В завершение выполните коррекцию дрейфа и выравнивание мультиплексных стеков изображений, как описано в текстовом протоколе. Метод последовательного иллюзорного и стационарного мечения был использован для получения мультиплексного MET STORM изображения микрокластеров и других структур в активированной Т-клетке Jurkat.

Финальное изображение MET STORM было скорректировано по дрифту и выравниванию с использованием усредненной коррекции по реперным точкам и FND-маркерам. Здесь представлены изображения микроскопии локализации одиночных молекул одного FND, локализованного в 30 000 кадрах, до и после коррекции дрифта с помощью усредненной коррекции по реперным точкам. Аналогично, здесь приведены изображения микроскопии локализации одиночных молекул активированной T-клетки Jurkat, окрашенной антителами к фосфорилированному SLP76 и FND-маркерами, до и после коррекции дрифта с помощью усредненной коррекции по реперным точкам.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнять мультиплексную суперразрешающую визуализацию белков в активированном T-лимфоците с помощью метода MET STORM. После освоения данной методики время проведения каждого раунда мультиплексирования составит три часа. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости сохранения неизменного положения образца на предметном столике микроскопа.

Это можно сделать с помощью зажимов предметного столика. Не забывайте, что работа с нашим модифицированным буфером STORM может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование респираторов и защитных очков.