Модифицированный анализ фрагментарных фрагментов для количественного определения длины теломера с использованием гибридизации в геле

Общая цель этой процедуры — определить длину теломер в эукариотических клетках с использованием модифицированной версии процедуры анализа фрагментов рестрикции теломер, описанной докторами Джерри В. Шеем, Вудрингом Райтом и коллегами. Предоставляя данные о длине теломер, процедура может ответить на вопросы по клеточной биологии, поведенческой медицине, эпидемиологии и инфекционным заболеваниям, о влиянии возраста, стресса, медикаментозного лечения и инфекций. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает прямое измерение в килооснованиях средней длины теломер в различных клетках.

Образцы геномной ДНК, подлежащие анализу, были извлечены из клеток с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК, как описано в текстовом протоколе. Выполните расщепление геномной ДНК в конечном объеме от 20 до 40 микролитров. Соедините в каждой микроцентрифужной пробирке следующее: три микрограмма геномной ДНК; 10x буфер для расщепления ДНК; один микролитр фермента рестрикции Rsa1; один микролитр фермента рестрикции Hinf1; и стерильная, деионизированная вода до конечного объема.

Кратковременно центрифугируйте, чтобы убедиться, что все компоненты находятся на дне пробирки. Инкубируйте пищеварительные процессы при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 16 часов. Начните эту процедуру с приготовления 0,6%-ного раствора агарозы, как описано в текстовом протоколе.

Подготовьте систему гель-электрофореза к литью в гель. Прикрепите торцевые затворы к лотку для литья геля. Как только раствор агарозного геля остынет до 50 градусов Цельсия, перелейте его в лоток для литья геля, поместите конус в гель и дайте гелю застыть в течение 45 минут без крышки при комнатной температуре.

Снимите торцевые затворы с литейного лотка и выньте гребень из геля. Заполните систему электрофореза гелем буфером для электрофореза до линии заполнения, убедившись, что гель полностью погружен в буфер. Загрузите лунки геля образцами ДНК, оставив между образцами пустую лунку.

Добавьте 10 микролитров лестницы ДНК в лунки на противоположных концах геля. Запустите гель-электрофорез при напряжении 150 вольт в течение 30 минут, чтобы быстро переместить ДНК в гель. Через 30 минут отрегулируйте напряжение до 57 вольт и работайте от 18 до 24 часов.

После того, как гель продлится от 18 до 24 часов, выключите источник электротрофореза и извлеките лоток для отливки геля с гелем из буфера для электроофореза. Срез верхнего правого угла геля должен служить ориентиром для ориентации геля. Отрежьте лист фильтровальной бумаги до размера чуть больше геля.

Поместите фильтровальную бумагу поверх геля в лоток для литья и дайте бумаге впитать излишки раствора на геле. Осторожно удалите пузырьки воздуха между фильтровальной бумагой и гелем, используя пипетку в качестве валика, чтобы выдавить пузырьки через боковые стороны. Извлеките гель из лотка для литья, перевернув гель и фильтровальную бумагу так, чтобы бумага оказалась под гелем.

Переложите гель с фильтровальной бумагой в гелевую сушилку и накройте его полиэтиленовой пленкой. Удалите все пузырьки воздуха между полиэтиленовой пленкой и гелем, используя пипетку в качестве валика. Высушите гель при температуре 50 градусов Цельсия в течение двух часов.

Как только гель высохнет, снимите полиэтиленовую пленку и переложите гель и фильтровальную бумагу в стеклянную посуду, содержащую 250 миллилитров деионизированной воды. Аккуратно снимите фильтровальную бумагу, и выдержите гель при комнатной температуре в течение 15 минут. Нанесите гель поверх нейлоновой сетки размером 12 на 12 дюймов.

Скатайте капроновую сетку и гель вместе, следя за тем, чтобы гель не соприкасался сам с собой. Поместите сетку и гель в гибридизационную трубку. Смешайте 100 миллилитров 5x SSC и 12 микролитров зеленого флуоресцентного красителя для нуклеиновых кислот и поместите в гибридизационную пробирку.

Выдерживать 30 минут при температуре 42 градуса Цельсия в гибридизационной печи с вращением. Берегите раствор от света. Через 30 минут извлеките капроновую сетку и гель из пробирки для гибридизации.

Раскатайте и поставьте в стеклянную посуду, содержащую 250 миллилитров деионизированной воды. Аккуратно снимите капроновую сетку. Визуализируйте гель с помощью фосфоримиджера с указанными настройками.

Подготовьте зонд радиоактивных теломер в соответствии с установленными на предприятии правилами обращения с радиоактивностью. В микроцентрифужной пробирке соедините следующее:два микролитра теломерного зонда; 2,5 микролитра 10-кратного реакционного буфера полинуклеотидкиназы; три микролитра к АТФ, меченной по гамма-фосфатной группе с Р32; четыре микролитра Т4-полинуклеотидкиназы; и не содержащая ДНКазы, стерильная, деионизированная вода до конечного объема 20 микролитров. Кратковременно центрифугируйте пробирку.

Выдержите трубку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Кратковременно центрифугируйте пробирку и инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение 20 минут, чтобы остановить реакцию. Загрузите раствор радиоактивного зонда в подготовленную хроматографическую колонку G25 и центрифугируйте в течение двух минут при 700-кратном избежении.

Сохраните фильтрат, в котором находится радиоактивный теломерный зонд. Поместите гель в стеклянную посуду, содержащую 250 миллилитров денатурирующего раствора, и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Удалите денатурирующий раствор и замените его 250 миллилитрами стерильной, деионизированной воды.

Выдерживать в течение 10 минут на орбитальном вибростенде при комнатной температуре. Удалите деионизированную воду. Замените 250 миллилитров нейтрализующего раствора и выдержите 15 минут при комнатной температуре.

Скатайте гель в капроновую сетку, и поместите в пробирку для гибридизации. Добавьте 20 миллилитров раствора для гибридизации, и выдержите в печи для гибридизации при температуре 42 градуса Цельсия в течение 10 минут с вращением. Через 10 минут удалите раствор для гибридизации и замените 20 миллилитрами свежего раствора для гибридизации.

Добавьте весь теломерный зонд и инкубируйте в гибридизационной печи при температуре 42 градуса Цельсия с вращением в течение ночи. Когда гибридизация с помощью теломерного зонда будет завершена, удалите гель и сетку из гибридизационной трубки и поместите в стеклянную чашку, содержащую 250 миллилитров 2x SSC. Разверните и снимите капроновую сетку с посуды.

Поместите стеклянную чашку на орбитальный шейкер и выдерживайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Извлеките 2x SSC, замените 250 миллилитров 0,1x SSC, плюс 0,1% раствор SDS, и выдерживайте в течение 15 минут на орбитальном шейкере при комнатной температуре. Удалите 0,1x SSC плюс 0,1% SDS раствор.

Замените 250 миллилитров 2х SSC и выдерживайте еще 15 минут на орбитальном шейкере. Удалите гель из 2x SSC и заверните гель в пищевую пленку. Удалите все пузырьки и воздушные карманы между гелем и полиэтиленовой пленкой.

Поместите гель в экспозиционную кассету с люминофорным экраном и подвергните люминофорный экран воздействию геля на ночь. На следующий день используйте люминофорный тепловизор для изображения экспонированного люминофорного экрана. Изображения люминофора впоследствии используются для количественного определения длины теломер, как описано в текстовом протоколе.

Три концентрации ДНК, выделенные из иммортализированной клеточной линии фибробластов крайней плоти человека и мононуклеарных клеток периферической крови человека, были проанализированы на длину теломер. На этом люминофорном изображении высушенного геля агерозы, окрашенного зеленым флуоресцентным пятном для нуклеиновых кислот, показано расположение полос лестницы ДНК в первой и восьмой полосах. Расстояние, измеренное от верхней части геля до каждого стандарта молекулярной массы, обозначено синими стрелками.

После гибридизации с помощью теломерного зонда полосы теломер проявляются в виде мазков на каждой полосе. Сетки из 150 коробок, были рассчитаны для каждой полосы плюс одна фоновая полоса. Показаны выбранные области анализа для каждого набора образцов.

Для каждого набора образцов были выбраны отдельные фоновые полосы, обозначенные буквой B, чтобы обеспечить одинаковую интенсивность фона для каждого набора образцов. Расчет средней длины теломер показал более высокую среднюю длину теломер в иммортализированной клеточной линии, чем в мононуклеарных клетках периферической крови человека. Эти результаты также демонстрируют, что количество анализируемой геномной ДНК в каждой полосе имеет решающее значение для получения обнаруживаемого сигнала после гибридизации.

После освоения эта техника может быть выполнена за 12 часов, распределенных на 2 1/2 дня, с двумя ночными инкубациями, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости использовать не менее трех микрограммов ДНК для каждого образца и измерять каждый образец в двух экземплярах. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области старения к изучению механизмов, ответственных за поддержание длины теломер у различных видов животных, включая человека.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как непосредственно определить среднюю длину самих теломер. Не забывайте, что работа с радиоактивностью может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторных халатов и перчаток.