Определение остаточного доноров эритроидных клеток-предшественников после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с Hemoglobinopathies

Общая цель данной процедуры заключается в мониторинге химеризма при трансплантации стволовых клеток. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области трансплантологии, такие как приживаемость гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с гемоглобинопатиями. Основное преимущество данного метода заключается в сочетании сортировки клеток с помощью проточной цитометрии, анализа с использованием колонок и последующего анализа коротких тандемных повторов для оценки пролиферации и дифференцировки предшественников в эритроидном compartmentе.

Значение данного метода выходит за рамки терапии отторжения трансплантата, так как он может помочь выявить пациентов, склонных к рецидиву заболевания, и инициировать последующие иммуномодулирующие стратегии. Кроме того, он может быть применен в будущих клинических исследованиях, исследованиях стволовых клеток и при планировании испытаний методов терапии кожи. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку процесс освоения затруднителен и требует выполнения квалифицированным персоналом.

Эту процедуру продемонстрирует Элизабет Хофлехнер, техник моей лаборатории. Для начала необходимо подготовить суспензию единичных клеток из образца костного мозга для окрашивания жира. Для этого поместите костный мозг в клеточный фильтр и закрутите его сверху на центрифужную пробирку.

Используйте поршень шприца, чтобы продавить фрагменты ткани через сетку. Чтобы собрать весь материал, промойте систему несколькими миллилитрами суспензионного буфера. Добавьте три миллилитра градиентной среды в центрифужную пробирку и осторожно наслоите на нее суспензию одиночных клеток.

Центрифугируйте пробирку при 550 G при 20 °C в течение 30 минут, установив ускорение на девять, а торможение — на ноль. С помощью пипетки удалите верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, стараясь не задеть слой мононуклеарных клеток на границе раздела фаз. Перенесите этот слой мононуклеарных клеток в центрифужную пробирку.

Затем промойте клетки 10 миллилитрами суспензионного буфера. Центрифугируйте пробирку при 250 G при температуре четырех градусов Цельсия в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в двух миллилитрах модифицированной среды Dulbecco по Isokov, используя дозирование пипеткой.

Для определения концентрации клеток с помощью гемоцитометра поместите 95 µL 2% раствора трипанового синего в планшет на 96 лунок. Добавьте 5 µL клеточной суспензии, тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение короткого времени. Заполните гемоцитометр и исследуйте его под микроскопом.

Подсчитайте только окрашенные жизнеспособные клетки. После этого центрифугируйте клеточную суспензию при 250 G при 25 °C в течение 10 минут. Для блокировки FC-рецептора используйте 2.5 µg блокирующего агента на 100 µL.

Инкубируйте на льду от 10 до 15 минут. Добавьте смесь предварительно титрованных моноклональных антител, соответствующую объему, используемому для окрашивания клеток. Инкубируйте при 4 °C в темноте в течение 20 минут.

Промойте клетки тремя миллилитрами буфера для окрашивания, после чего центрифугируйте. Отрегулировав концентрацию клеток, перенесите клеточную суспензию в стандартную пробирку для проточной цитометрии, пропустив её через фильтр для клеток с размером пор 70 µm для удаления агрегатов. Затем настройте и оптимизируйте работу сортировщика клеток и программного обеспечения в соответствии с инструкциями производителя.

Настройте шаблон, включающий двумерный график для отображения прямого светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC). Чтобы привести популяцию интересующих клеток к соответствующему масштабу, пропустите клетки через сортер и отрегулируйте значения FSC и SSC. Начните с записи данных для пробирки с отрицательным контролем, после чего запишите данные для каждой пробирки с контролем компенсации одиночного окрашивания и рассчитайте компенсацию.

После этого отобразите экспериментальные образцы на двухмерном точечном графике FSC/SSC, чтобы включить как лимфоцитарные, так и миелоидные клетки. Сравнивая различные сигналы FSC, исключите дублеты и агрегаты. Затем визуализируйте одиночные клетки, экспрессирующие CD45 и CD36, на двухмерном точечном графике.

События, положительные по CD45, представляют лейкоциты и их предшественники. События, отрицательные по CD45 и положительные по CD36, представляют эритроидные предшественники. Для определения CD36-положительных и CD45-положительных клеток используйте инструменты гейтирования, после чего визуализируйте CD45-положительные события и еще один точечный график, отображающий параметры CD34 и SSC.

Затем с помощью инструментов гейтирования выделите CD34-положительные клетки (прогениторы лейкоцитов) и клетки с высоким уровнем SSC (миелоидные клетки на различных стадиях дифференцировки). После этого настройте гейты для сортировки в отдельные пробирки для сбора. В завершение проведите сортировку клеток при температуре 4 °C до получения необходимого количества клеток.

Разбавьте клетки, добавив полную среду IMDM с добавлением рекомбинантного эритропоэтина человека или EPO. Перенесите 300 µL разбавленных клеток в 3 mL среды H4434 и инкубируйте при перемешивании при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем распределите по трем чашкам диаметром 35 мм по 1 mL клеточной суспензии в каждую.

Поместите две чашки с культурой вместе с третьей чашкой, заполненной водой, в планшет для 100-миллиметровых чашек. Культивируйте эти клетки в увлажненном инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 14 дней. Используя инвертированный микроскоп с 40-кратным увеличением и чашку для культивирования с нанесенной разметочной сеткой, проведите подсчет колоний в соответствии с их морфологией.

Классифицируйте колониеобразующие единицы или CFU на мультипотентные клетки-предшественники, гранулоцитарно-моноцитарные клетки-предшественники, эритроидные единицы, образующие эксплозивные колонии (BFU-E), и эритроидные колониеобразующие единицы (CFU-E). Для начала выделите клетки из флаконов или планшета для анализа CFU согласно текстовому протоколу и приступите к экстракции ДНК. После центрифугирования клеток используйте автоматический прибор для изоляции ДНК крови, чтобы выделить нуклеиновую кислоту из осадка.

Измерьте концентрацию ДНК с помощью флуориметра. Подготовьте образцы в соответствии с инструкциями производителя, затем поместите образец в измерительную камеру флуориметра. Для постановки ПЦР-реакции согласно руководству добавьте разведенную ДНК в смесь ДНК-полимеразы, набора праймеров и реакционной смеси.

В качестве отрицательного контроля используйте ДНК донора и реципиента, полученную до трансплантации, а также воду, свободную от нуклеаз; в качестве положительного контроля используйте образец 9947A. Для анализа результатов ПЦР добавьте по 10 µL образцов денатурированной ДНК в лунки реакционного планшета на 96 лунок. Закройте планшет герметичной крышкой, подвергните краткими центрифугированию и поместите на лед.

Мегакариоцитарно-эритроидные предшественники были отобраны как популяция, положительная по антигену CD36 и отрицательная по CD45. Кроме того, клетки, положительные по CD45 и CD34, были идентифицированы как лимфоидно-миелоидные предшественники, а клетки, положительные по CD45 с высоким сигналом SSC, — как зрелые миелоидные клетки. Чистота эритроидных клеток-предшественников после сортировки составила более 85%, а чистота миелоидных клеток — более 95%. Клетки костного мозга, отделенные с помощью специфических магнитных бусин к CD34, культивировали в течение 14 дней.

Некоторые из этих клеток, по-видимому, пролиферируют, дифференцируются и образуют колонии. Стимуляция различными концентрациями EPO усилила образование выраженных красных эритроидных колоний. ПЦР-анализ коротких тандемных повторов (STR), специфичных для ДНК реципиента и донора, позволяет обнаружить химеризм в клетках.

Данный метод позволил успешно определить количество ДНК реципиента по сравнению с ДНК донора в клетках, полученных путем сортировки клеток костного мозга, а также в клетках, полученных в ходе клоногенного анализа. После освоения эта техника может быть выполнена за четыре часа при условии правильного соблюдения протокола. При выполнении данной процедуры важно помнить, что этот метод требует стандартизации и должен проводиться appropriately обученным персоналом.

После выполнения данной процедуры можно провести дальнейший анализ остаточных эритроидных клеток-предшественников донора, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как наличие селективного преимущества генетически скорректированных эритроидных стволовых клеток. После своей разработки этот метод открыл исследователям в области трансплантации стволовых клеток возможность изучать пролиферацию и дифференцировку предшественников в эритроидном компартменте. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как осуществлять мониторинг приживления после трансплантации стволовых клеток у пациентов с гемоглобинопатиями.