Перепрограммирование первичной амниотической жидкости и мембраны клеток для плюрипотентности в условиях Xeno бесплатно

Общая цель этой процедуры заключается в эффективном получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток путем эписомального перепрограммирования из двух различных видов фетальных стволовых клеток. Этот метод может помочь обеспечить источник плюрипотентных стволовых клеток для тканевой инженерии, моделирования заболеваний, фундаментальных исследований или лонгитюдных исследований. Основное преимущество этого метода заключается в том, что перепрограммирование и созревание ИПСК происходит в химически определенных условиях, будучи доступными на ранних этапах для потенциальной педиатрической клеточной терапии.

Демонстрировать эту процедуру будут Стивен Макклеллан, главный исследователь, и я. Получите плаценту как можно скорее после рождения. Отрежьте девятиугольный сантиметровый отрезок амниона, и промойте его в 50-миллиметровой центрифужной пробирке с 30 миллилитровыми ПБС с добавлением антибиотического, антимикотического раствора.

Удалите сгустки крови с мембран, а затем с помощью пары тонких скальпелей измельчите мембраны на мелкие кусочки в стерильной 10-сантиметровой чашке для культивирования тканей. Лезвиями скальпеля перенесите измельченную мембранную тканевую массу в одну тканевую диссоциационную трубку, содержащую 4,7 миллилитров среды RPMI-1640. Смешайте ферменты диссоциации.

Установите трубку на диссоциатор тканей и запустите программу h_tumor_01. Затем инкубируйте трубку при температуре 37 градусов Цельсия на качающейся платформе в течение 30 минут. Далее разбавьте суспензию 35 миллилитрами РПМИ-1640 и нанесите на 70-микронный фильтр, помещенный над 50-миллилитровой центрифужной пробиркой.

Центрифуга в течение пяти минут при 200 умноженных на г при комнатной температуре. После выброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах РПМИ-1640, и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Засейте клетки в клеточных кластерах с плотностью примерно 10 000 клеток на квадратный сантиметр в колбы для тканевых культур свежеприготовленной средой AFMC с добавлением антибиотика, антимикотического раствора.

Соберите амниотическую жидкость с низким числом пассажа и мембранные стволовые клетки для перепрограммирования из одной колбы Т75 путем добавления двух миллилитров фермента клеточной отслойки в клеточный лист. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-восьми минут. После центрифугирования при 200-кратном g в течение 45 минут суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS, и хорошо перемешайте, чтобы смыть компоненты сыворотки.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Затем отрегулируйте плотность ячеек до 100 000 клеток на миллилитр PBS, а теперь упаковали в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки. Поместите микроцентрифужные пробирки в пятимиллилитровые полистирольные пробирки, чтобы обеспечить центрифугирование в обычном качающемся руле, и центрифугируйте при 200-кратном g в течение четырех минут при комнатной температуре.

После отжима переверните пробирки и выбросьте надосадочную жидкость в контейнер для отходов, а затем выполните дополнительный этап центрифугирования при 200-кратном g в течение трех минут. После отжима с помощью пипетки объемом 200 микролитров осторожно отсосите оставшуюся жидкость из пробирок. Поместите наконечники для трансфекции, трубку, буфер для ресуспензии и электролитический буфер в шкаф для культивирования тканей.

Переместите трансфекционное устройство вплотную так, чтобы его станцию метро можно было разместить непосредственно в шкафу. Заполните одну трансфекционную трубку тремя миллилитрами электролитического буфера и установите трубку в станцию, протолкнув ее до упора внутрь щели. Достаньте из хранилища при температуре минус 80 градусов Цельсия заранее подготовленные аликвоты перепрограммированного плазмидного раствора и дайте им оттаять при комнатной температуре в шкафу для культур.

Установите параметры трансфекции на устройстве для подачи одного импульса продолжительностью 40 миллисекунд при напряжении 950 вольт. Ресуспендируйте гранулу, содержащую 100 000 клеток, в 10 микролитрах буфера для ресуспензии. Работая быстро, добавьте 1/10 перепрограммирующего плазмидного раствора в ресуспендированные клетки.

Установите наконечник для трансфекции на пипетку для трансфекции. Затем отсасывайте клеточную суспензию в трансфекционный наконечник, осторожно избегая образования пузырьков воздуха. Вставьте трансфекционную пипетку в трансфекционную трубку.

И нажмите кнопку запуска на экране у трансфекционного устройства. Дождитесь появления на экране сообщения об успешном проведении трансфекции. Затем немедленно извлеките пипетку из пробирки.

Вытолкните суспензию в одну лунку из целевых шестилуночных планшетов. Вмешайте среду из соседней лунки, и распределите суспензию поровну по обеим лункам. Повторите трансфекцию для каждой микроцентрифужной пробирки с клетками.

Начните с добавления 30 микролитров 0,5 миллимолярной ЭДТА и PBS в пять ПЦР-пробирок. Затем загрузите наконечник в пипетку объемом 10 микролитров, установленную на два микролитра. Держите кончик пипетки под углом к краю колонии и осторожно и постепенно соскребите всю колонию с поверхности.

Немедленно аспирируйте всю колонию в наконечник пипетки и перенесите ее в одну из подготовленных пробирок для ПЦР с ЭДТА. Повторив процесс с четырьмя другими колониями, инкубируйте при комнатной температуре от четырех до шести минут. Используйте больший наконечник пипетки, чтобы аккуратно дозировать каждую клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы разбить колонию на более мелкие комки.

Избегайте создания одноклеточной суспензии. Затем поместите суспензию непосредственно в целевую лунку 24-луночного планшета, покрытого рекомбинантным витронектином. Повторив процесс для остальных колоний, инкубируйте от трех до шести дней.

Через четыре-шесть дней, когда колонии разрастутся и станут компактными, промойте клеточные листы 300 микролитрами 0,5 миллимолярной ЭДТА, и немедленно отаспирируйте. Затем добавьте еще 300 микролитров, и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. После аспирации ЭДТА установите дозатор объемом один миллилитр на полную емкость, установите его на наконечник шириной в один миллилитр и аспирируйте среду E8 из целевой лунки шестилуночного планшета, покрытого витронектином.

Распылите струю среды на одну лунку исходной пластины, чтобы смыть культуру iPSC. Затем перенесите суспензию в целевую лунку и пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить колонии на скопления от 20 до 40 клеток. После покрытия всех ячеек убедитесь, что комки распределены равномерно, осторожно покачивая и встряхивая пластину.

Затем верните планшет в инкубатор для сращивания комков и роста колонии. Амниотическая жидкость и мембранные стволовые клетки, представляющие собой исходные клетки для перепрограммирования, демонстрируют типичную мезенхимальную морфологию: удлиненную и фазово-яркую. Эпителиальные свойства клетки приобретают после того, как они претерпевают переход из мезенхимального в эпителиальный, что приводит к образованию колоний с клетками, похожими на булыжники.

Эти колонии размножаются и создают нерегулярные клеточные массы MET-клеток. На более поздних стадиях перепрограммирования появляются колонии полностью перепрограммированных клеток, индивидуально различимых клеток с четко определенными границами. Эти полностью перепрограммированные клетки присутствуют рядом с колониями MET, которые более многочисленны.

Здесь показан полностью перепрограммированный изолированный зрелый клон. После образования и созревания ИПСК они могут быть подвергнуты детальной характеристике и направлены на дифференцировку в различные типы клеток. Не стоит забывать, что работа с тканями человека, которые не были проверены на наличие патогенов, может быть крайне опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать такие меры предосторожности, как средства индивидуальной защиты, так и работа в шкафу биобезопасности.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как индуцировать плюрипотентность в фетальных стволовых клетках, какие реагенты и оборудование использовать, а также как регулярно культивировать плюрипотентные стволовые клетки.