Применение автоматизированного патч-зажима для изображений для изучения нейронов в средах мозга
July 31st, 2017
В этом протоколе описывается, как проводить автоматические эксперименты по патч-зажимам с использованием изображений с использованием системы, недавно разработанной для стандартного электрофизиологического оборудования in vitro .
Общая цель этой технологии заключается в использовании компьютерного зрения для автоматического обнаружения флуоресцентных клеток и выполнения автоматического зажима этих клеток в острых срезах мозга. Этот метод может помочь преодолеть ключевые трудности в области электрофизиологии патч-клэмпа, такие как идентификация, нацеливание и патч-клэмпинг флуоресцентно меченных клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может автоматически обнаруживать патч-пипетки, флуоресцентные клетки и интегрировать этапы с автоматическим зажимом патча.
Это нововведение значительно увеличивает производительность эксперимента. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику неврологических расстройств, поскольку высокопроизводительный автоматический зажим под визуальным контролем может быть использован для фармакологического скрининга более физиологичных препаратов нейронов. Этот метод также может быть применен к другим препаратам in vitro, таким как нейронные органеллы типик или культуры срезов, диссоциирующие нейроны, а также любые ненейрональные клетки.
Чтобы начать эту процедуру, включите усилитель, контроллер микроскопа и контроллер манипулятора. Затем запустите Autopatcher IG с помощью python из терминала командной строки, сначала изменив директорию, в которой установлен Autopatcher IG. Далее введите Python Autopatcher_IG.
PYW в терминале командной строки и нажмите клавишу ввода. После этого заполните всю стеклянную пипетку внутренним раствором и загрузите ее на головной стол. Переместите наконечник пипетки в поле зрения микроскопа и сфокусируйте его.
Если циферблат используется для перемещения манипуляторов в предметном столике микроскопа, обновите координаты, нажав Z на клавиатуре. Первичная калибровка преобразует угол и расстояние перемещения манипулятора в систему координат микроскопа. Манипулятор движется в трех направлениях с заданным расстоянием, а программное обеспечение определяет координаты наконечника пипетки в поле зрения микроскопа.
Нажмите кнопку «Начать калибровку» в главном графическом интерфейсе пользователя для соответствующего устройства, на которое загружена пипетка. Впоследствии сохраните калибровку, нажав кнопку «Сохранить калибровку» в нижней части основного графического интерфейса. Эта первичная калибровка должна быть выполнена только один раз, если не будет изменена физическая организация буровой установки.
На этом этапе поместите один срез мозга в центр записывающей камеры. Стабилизируйте срез мозга с помощью зажима для среза или арфы. Чтобы обнаружить флуоресцентную ячейку, найдите интересующую область при четырехкратном увеличении.
Затем переместите предметный столик микроскопа, включив режим «Щелчок для перемещения», и щелкните центр интересующей области. В качестве альтернативы можно использовать клавиатуру для перемещения предметного столика микроскопа. Затем переключитесь на объектив с большим увеличением и отрегулируйте фокусировку, перемещая микроскоп по оси Z с помощью радиомодуля RF на клавиатуре.
Программное обеспечение направляет микроскоп и камеру на получение серии изображений на разной глубине. Затем эти изображения подвергаются обработке компьютерным зрением, чтобы найти флуоресцентно меченые клетки. Конечным результатом является список обнаруженных координат ячейки.
Нажмите кнопку обнаружения ячейки в нулевой колонке основного графического интерфейса. Если светодиодным или лазерным источником света установки невозможно управлять по сигналу TTL, включите светодиод или лазер вручную. При необходимости выключите светодиод или лазер.
Список координат ячеек появится в графическом интерфейсе позиций памяти. Удалите ненужные ячейки из списка, нажав кнопку X рядом с координатами. В качестве альтернативы, если целевые клетки не помечены флуоресцентной меткой, щелкните режим мыши в основном графическом интерфейсе.
Затем, кликните по интересующей ячейке, на ячейке появится желтая точка с числом и координаты ячейки появятся в графическом интерфейсе позиций памяти. Чтобы выполнить вторичную калибровку с целью определения координат смещения пипетки, заполните 1/3 стеклянной пипетки внутренним раствором. Затем загрузите пипетку на держатель пипетки, прикрепленный к головному столику.
При малом увеличении используйте один и два на клавиатуре для переключения между первым и вторым модулем. Затем выведите пипетку в поле зрения и отрегулируйте фокусировку с помощью клавиатуры. Затем загрузите первичную калибровку, нажав на кнопку «Загрузить калибровку».
Переключите объектив микроскопа в режим большого увеличения и нажмите 40 раз на главном графическом интерфейсе. Поднесите кончик пипетки к центру. Затем нажмите кнопку вторичной калибровки в главном графическом интерфейсе пользователя под используемым устройством.
Чтобы пропатчить целевую клетку, нажмите на кнопку управления патчами, чтобы открыть графический интерфейс управления патчами. Нажмите кнопку «Перейти» рядом с интересующей ячейкой в списке координат в графическом интерфейсе позиции памяти. Затем нажмите кнопку CTM устройства в основном графическом интерфейсе, чтобы включить движение.
Нажмите на интересующую ячейку, чтобы переместить наконечник пипетки в ячейку. Из-за механической ограниченности манипулятора, при перемещении на расстояние более 500 микрометров, может возникнуть небольшая ошибка позиционирования. Чтобы предотвратить большую механическую ошибку позиционирования, вторичная калибровка должна быть выполнена рядом с целевой ячейкой.
Далее с помощью выбранной кнопки устройства необходимо переключить входной сигнал между двумя блоками. Нажмите на кнопку патча в графическом интерфейсе управления патчами. Начнется автоматическая установка патчей, и давление и сопротивление можно будет контролировать с помощью графического интерфейса управления патчами.
Алгоритм автоматического патчинга отслеживает сопротивление и контролирует давление через серию логических петель, образуя гигауплотнение. Всплывающее окно оповещает об образовании гигапечати. Система использует изменение сопротивления для распознавания контакта между клеткой и поверхностью.
В ситуации, когда контакт клетки с поверхностью не обнаружен вовремя, используйте кнопку «Далее» для перехода к этапу коммутации, оставаясь при этом в том же испытании автоматического патчинга. Управляйте автоматическим процессом в любой момент, нажимая на соответствующие кнопки в графическом интерфейсе управления патчами. Затем выберите «Да», чтобы выполнить обкатку с помощью комбинированного Zap и всасывания.
В качестве альтернативы выберите «нет», чтобы проникнуть только с помощью отсасывания. Затем сохраните журнал патчей эксперимента. На этом рисунке показаны выбранные места, загруженные в графический интерфейс последовательности команд.
В левом столбце отображается список координат, а в правом столбце — список команд в виде TTL-сигналов для каждого местоположения. Вот скриншоты во время эксперимента по применению препарата, соответствующие трем выбранным локациям. Раствор KCL смешивали с красным флуоресцентным красителем с целью визуализации.
Первой единицей была KCL-содержащая пипетка, а второй единицей была патч-пипетка. На этом рисунке инъекции шагового тока показывают регулярный спайковый нейрон. Здесь показаны клещи напряжения, записывающие следы от локального применения 500 миллимолярного раствора хлорида калия в трех местах.
Красный след с внутренним током был зарегистрирован из исследования, когда применение хлорида калия было близко к ячейке пластыря. Красной стрелкой обозначены сроки применения хлористого калия. Используя этот метод, можно провести пробную заплатку за четыре минуты без обширной подготовки по сравнению с ручной заплаткой.
После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как оптогенетика, хемогенетика и фармакологические манипуляции, чтобы ответить на вопросы, связанные с вашим исследовательским проектом. После своего развития этот метод может проложить путь исследователям в области нейробиологии к изучению высокопроизводительных исследований синаптических рецепторов и ионных каналов в различных препаратах in vitro. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить автоматизированные эксперименты с патч-хомутами под визуальным контролем.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол описывает метод проведения автоматических патч-клемп-экспериментов с использованием руководства по изображениям и передовых технологий компьютерного зрения. Этот подход повышает эффективность идентификации и нацеливания на флуоресцентно-метченные клетки в острых срезах мозга.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Электрофизиология
- Нейробиология
- Изображения
Предисловие
- Патч-клемп электрофизиология является важным для исследования нейронной активности.
- Идентификация и нацеливание на конкретные клетки может быть сложной.
- Автоматизированные методы могут улучшить пропускную способность эксперимента.
- Флуоресцентное маркирование помогает в идентификации клеток.
Цель исследования
- Автоматизировать обнаружение флуоресцентно-метченных клеток для патч-клемп-экспериментов.
- Повысить эффективность электрофизиологических записей.
- Способствовать фармакологическому скринингу в нейронных препаратах.
Используемые методы
- Технология компьютерного зрения для обнаружения клеток.
- Автоматизированное патч-клемп оборудование для записи.
- Интеграция процессов обнаружения и записи.
- Применение к различным in vitro нейронным препаратам.
Основные результаты
- Успешная автоматизация идентификации клеток и патч-клемп.
- Повышение пропускной способности для электрофизиологических экспериментов.
- Потенциальные применения в фармакологических исследованиях.
- Универсальность применения к различным типам клеток.
Выводы
- Эта техника значительно повышает эффективность эксперимента.
- Она решает ключевые задачи в традиционных методах патч-клемп.
- Подход имеет последствия для исследований неврологических расстройств.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
