Применение автоматизированного патч-зажима для изображений для изучения нейронов в средах мозга
31 июля 2017 г.
В этом протоколе описывается, как проводить автоматические эксперименты по патч-зажимам с использованием изображений с использованием системы, недавно разработанной для стандартного электрофизиологического оборудования in vitro .
Общая цель этой технологии заключается в использовании компьютерного зрения для автоматического обнаружения флуоресцентных клеток и выполнения автоматического зажима этих клеток в острых срезах мозга. Этот метод может помочь преодолеть ключевые трудности в области электрофизиологии патч-клэмпа, такие как идентификация, нацеливание и патч-клэмпинг флуоресцентно меченных клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может автоматически обнаруживать патч-пипетки, флуоресцентные клетки и интегрировать этапы с автоматическим зажимом патча.
Это нововведение значительно увеличивает производительность эксперимента. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику неврологических расстройств, поскольку высокопроизводительный автоматический зажим под визуальным контролем может быть использован для фармакологического скрининга более физиологичных препаратов нейронов. Этот метод также может быть применен к другим препаратам in vitro, таким как нейронные органеллы типик или культуры срезов, диссоциирующие нейроны, а также любые ненейрональные клетки.
Чтобы начать эту процедуру, включите усилитель, контроллер микроскопа и контроллер манипулятора. Затем запустите Autopatcher IG с помощью python из терминала командной строки, сначала изменив директорию, в которой установлен Autopatcher IG. Далее введите Python Autopatcher_IG.
PYW в терминале командной строки и нажмите клавишу ввода. После этого заполните всю стеклянную пипетку внутренним раствором и загрузите ее на головной стол. Переместите наконечник пипетки в поле зрения микроскопа и сфокусируйте его.
Если циферблат используется для перемещения манипуляторов в предметном столике микроскопа, обновите координаты, нажав Z на клавиатуре. Первичная калибровка преобразует угол и расстояние перемещения манипулятора в систему координат микроскопа. Манипулятор движется в трех направлениях с заданным расстоянием, а программное обеспечение определяет координаты наконечника пипетки в поле зрения микроскопа.
Нажмите кнопку «Начать калибровку» в главном графическом интерфейсе пользователя для соответствующего устройства, на которое загружена пипетка. Впоследствии сохраните калибровку, нажав кнопку «Сохранить калибровку» в нижней части основного графического интерфейса. Эта первичная калибровка должна быть выполнена только один раз, если не будет изменена физическая организация буровой установки.
На этом этапе поместите один срез мозга в центр записывающей камеры. Стабилизируйте срез мозга с помощью зажима для среза или арфы. Чтобы обнаружить флуоресцентную ячейку, найдите интересующую область при четырехкратном увеличении.
Затем переместите предметный столик микроскопа, включив режим «Щелчок для перемещения», и щелкните центр интересующей области. В качестве альтернативы можно использовать клавиатуру для перемещения предметного столика микроскопа. Затем переключитесь на объектив с большим увеличением и отрегулируйте фокусировку, перемещая микроскоп по оси Z с помощью радиомодуля RF на клавиатуре.
Программное обеспечение направляет микроскоп и камеру на получение серии изображений на разной глубине. Затем эти изображения подвергаются обработке компьютерным зрением, чтобы найти флуоресцентно меченые клетки. Конечным результатом является список обнаруженных координат ячейки.
Нажмите кнопку обнаружения ячейки в нулевой колонке основного графического интерфейса. Если светодиодным или лазерным источником света установки невозможно управлять по сигналу TTL, включите светодиод или лазер вручную. При необходимости выключите светодиод или лазер.
Список координат ячеек появится в графическом интерфейсе позиций памяти. Удалите ненужные ячейки из списка, нажав кнопку X рядом с координатами. В качестве альтернативы, если целевые клетки не помечены флуоресцентной меткой, щелкните режим мыши в основном графическом интерфейсе.
Затем, кликните по интересующей ячейке, на ячейке появится желтая точка с числом и координаты ячейки появятся в графическом интерфейсе позиций памяти. Чтобы выполнить вторичную калибровку с целью определения координат смещения пипетки, заполните 1/3 стеклянной пипетки внутренним раствором. Затем загрузите пипетку на держатель пипетки, прикрепленный к головному столику.
При малом увеличении используйте один и два на клавиатуре для переключения между первым и вторым модулем. Затем выведите пипетку в поле зрения и отрегулируйте фокусировку с помощью клавиатуры. Затем загрузите первичную калибровку, нажав на кнопку «Загрузить калибровку».
Переключите объектив микроскопа в режим большого увеличения и нажмите 40 раз на главном графическом интерфейсе. Поднесите кончик пипетки к центру. Затем нажмите кнопку вторичной калибровки в главном графическом интерфейсе пользователя под используемым устройством.
Чтобы пропатчить целевую клетку, нажмите на кнопку управления патчами, чтобы открыть графический интерфейс управления патчами. Нажмите кнопку «Перейти» рядом с интересующей ячейкой в списке координат в графическом интерфейсе позиции памяти. Затем нажмите кнопку CTM устройства в основном графическом интерфейсе, чтобы включить движение.
Нажмите на интересующую ячейку, чтобы переместить наконечник пипетки в ячейку. Из-за механической ограниченности манипулятора, при перемещении на расстояние более 500 микрометров, может возникнуть небольшая ошибка позиционирования. Чтобы предотвратить большую механическую ошибку позиционирования, вторичная калибровка должна быть выполнена рядом с целевой ячейкой.
Далее с помощью выбранной кнопки устройства необходимо переключить входной сигнал между двумя блоками. Нажмите на кнопку патча в графическом интерфейсе управления патчами. Начнется автоматическая установка патчей, и давление и сопротивление можно будет контролировать с помощью графического интерфейса управления патчами.
Алгоритм автоматического патчинга отслеживает сопротивление и контролирует давление через серию логических петель, образуя гигауплотнение. Всплывающее окно оповещает об образовании гигапечати. Система использует изменение сопротивления для распознавания контакта между клеткой и поверхностью.
В ситуации, когда контакт клетки с поверхностью не обнаружен вовремя, используйте кнопку «Далее» для перехода к этапу коммутации, оставаясь при этом в том же испытании автоматического патчинга. Управляйте автоматическим процессом в любой момент, нажимая на соответствующие кнопки в графическом интерфейсе управления патчами. Затем выберите «Да», чтобы выполнить обкатку с помощью комбинированного Zap и всасывания.
В качестве альтернативы выберите «нет», чтобы проникнуть только с помощью отсасывания. Затем сохраните журнал патчей эксперимента. На этом рисунке показаны выбранные места, загруженные в графический интерфейс последовательности команд.
В левом столбце отображается список координат, а в правом столбце — список команд в виде TTL-сигналов для каждого местоположения. Вот скриншоты во время эксперимента по применению препарата, соответствующие трем выбранным локациям. Раствор KCL смешивали с красным флуоресцентным красителем с целью визуализации.
Первой единицей была KCL-содержащая пипетка, а второй единицей была патч-пипетка. На этом рисунке инъекции шагового тока показывают регулярный спайковый нейрон. Здесь показаны клещи напряжения, записывающие следы от локального применения 500 миллимолярного раствора хлорида калия в трех местах.
Красный след с внутренним током был зарегистрирован из исследования, когда применение хлорида калия было близко к ячейке пластыря. Красной стрелкой обозначены сроки применения хлористого калия. Используя этот метод, можно провести пробную заплатку за четыре минуты без обширной подготовки по сравнению с ручной заплаткой.
После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как оптогенетика, хемогенетика и фармакологические манипуляции, чтобы ответить на вопросы, связанные с вашим исследовательским проектом. После своего развития этот метод может проложить путь исследователям в области нейробиологии к изучению высокопроизводительных исследований синаптических рецепторов и ионных каналов в различных препаратах in vitro. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить автоматизированные эксперименты с патч-хомутами под визуальным контролем.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод проведения автоматизированных экспериментов с использованием техники патч-кламп под визуальным контролем с применением передовых технологий компьютерного зрения. Этот подход повышает эффективность идентификации и селективного воздействия на флуоресцентно-меченые клетки в острых срезах мозга.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Электрофизиология
- Нейронаука
- Методы визуализации
Теоретические сведения
- Электрофизиология с использованием метода патч-клампа имеет решающее значение для изучения нейрональной активности.
- Идентификация и выбор конкретных клеток могут быть затруднительны.
- Автоматизированные методы позволяют увеличить пропускную способность экспериментов.
- Флуоресцентное мечение облегчает идентификацию клеток.
Цель исследования
- Для автоматизации обнаружения флуоресцентных клеток при проведении экспериментов с методом патч-кламп.
- Для повышения эффективности электрофизиологических записей.
- Для упрощения фармакологического скрининга в нейрональных препаратах.
Используемые методы
- Технология компьютерного зрения для детектирования клеток.
- Автоматизированная установка патч-кламп для регистрации данных.
- Интеграция процессов детектирования и регистрации.
- Применение к различным нейронным препаратам in vitro.
Основные результаты
- Успешная автоматизация идентификации клеток и метода локальной фиксации мембраны (patch-clamping).
- Повышение пропускной способности электрофизиологических экспериментов.
- Потенциальные возможности применения в фармакологических исследованиях.
- Универсальность применения для различных типов клеток.
Выводы
- Данный метод значительно повышает эффективность экспериментов.
- Он позволяет решить основные проблемы традиционных методов патч-клампа.
- Этот подход имеет важное значение для исследования неврологических расстройств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Автоматизированный патч-кламп с визуальным контролем решает проблему ограниченной пропускной способности в нейронной электрофизиологии, обеспечивая масштабируемую функциональную валидацию мишеней ионных каналов и синаптических рецепторов. Эта возможность поддерживает рабочие процессы раннего поиска путем снижения технической вариабельности и повышения плотности данных для кампаний по идентификации ведущих соединений. Данный метод повышает прогностическую достоверность валидации мишеней, обеспечивая количественные и воспроизводимые электрофизиологические показатели на физиологически релевантных препаратах нейронов.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем прямого измерения возбудимости нейронов и синаптических свойств в флуоресцентно меченных клетках.
- Практическая ценность: снижает зависимость от квалификации оператора, стандартизируя выполнение метода патч-клампа для разных пользователей и центров.
- Прогностическая ценность: увеличивает объем получаемых данных за один эксперимент, обеспечивая статистическую достоверность исследований взаимодействия с мишенью и механизмов действия.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: позволяет получать стандартизированные препараты нейронов, подходящие для последующего фармакологического и генетического скрининга.
- Количественные показатели: обеспечивает получение данных о сопротивлении и давлении в режиме реального времени, что позволяет автоматизировать обнаружение формирования плотного контакта (seal) и оптимизировать процесс.
- Масштабируемость: поддерживает мультиплексное воздействие на несколько клеток в одном срезе, что увеличивает плотность эксперимента без пропорционального увеличения затрат времени оператора.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: облегчает изучение нейрональных фенотипов в острых срезах мозга с сохранением нативных нейронных связей и патофизиологического контекста.
- Трансляционная преемственность: связывает электрофизиологические исследования на этапе поиска с доклинической валидацией, обеспечивая согласованность результатов в различных модельных системах.
- Снижение механистических рисков: позволяет напрямую оценивать влияние соединений на функцию ионных каналов и паттерны нейронального возбуждения в интактной ткани.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы поисковой биологии в качестве этапа функциональной валидации после идентификации мишени и перед оптимизацией лида, обеспечивая электрофизиологическое подтверждение взаимодействия с мишенью в нативной нейрональной среде.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез за счет автоматизированной высокоточной регистрации нейрональной активности в ответ на фармакологические или генетические воздействия.
- Скрининг: повышает воспроизводимость и пропускную способность анализа, позволяя систематически оценивать влияние библиотек соединений на возбудимость нейронов и синаптическую передачу.
- Аналитика: предоставляет количественные электрофизиологические показатели (например, частоту спайков, входное сопротивление, вольт-амперные характеристики), которые позволяют определить зависимости «структура — активность» и селективность мишени.
- Трансляционные исследования: сохраняют физиологическую релевантность за счет регистрации активности нейронов в острых срезах мозга, что позволяет поддерживать нативные профили экспрессии и микроокружение.
- Корпоративное использование: создает базу многократно используемых возможностей электрофизиологического анализа, применимых в различных программах нейробиологических исследований, направленных на ионные каналы, GPCRs и синаптические белки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишеней за счет прямого количественного измерения функций нейронов в физиологически релевантных препаратах.
- Операционная ценность: Увеличивает пропускную способность экспериментов и снижает вариабельность за счет автоматизации обнаружения клеток, наведения и выполнения патч-записи.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более быстрое принятие решений о продолжении или прекращении разработки за счет получения надежных функциональных данных на ранних этапах процесса поиска.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе подтвержденной электрофизиологической модуляции в нейронных цепях, имеющих значение для конкретного заболевания.
Особенности реализации
- Для настройки системы и устранения неполадок требуются экспертные знания в области электрофизиологии, интеграции компьютерного зрения и работы с микроманипуляторами.
- Результат зависит от стабильности флуоресцентного мечения, надлежащей подготовки патч-пипеток и контроля условий окружающей среды для поддержания жизнеспособности срезов.
- Для обеспечения воспроизводимости результатов между различными экспериментами и пользователями необходимы стандартизированные программные протоколы и процедуры калибровки.
- Адаптация метода для ненейрональных или диссоциированных типов клеток может потребовать корректировки алгоритмов детектирования и параметров патч-клампа.
- Практические ограничения включают ошибки механического позиционирования при перемещении на большие расстояния и зависимость от оптимального соотношения сигнал/шум флуоресценции для надежного обнаружения клеток.
