Взаимодействие с мРНК из протопластов растений

Общая цель этого оптимизированного интерактомного захвата мРНК заключается в выделении и идентификации связанного с мРНК протеома из растительных клеток. Этот метод применяется к протопластам мезофил листьев арабидопсиса талиана, типу клеток, используемому в качестве универсального инструмента в различных клеточных анализах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области посттранскрипционной регуляции генов имплантатов, такие как открытие и понимание роли растительных мессенджеров РНК-связывающих белков.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет изолировать и идентифицировать растительного мессенджера на связанном протеоме непосредственно из физиологической среды. Таким образом, этот метод может дать представление о белке, связанном с матричной РНК, из протопластов мезофил листьев арибидопсиса. Его также можно применять к другим системам, таким как протопласты или ткани других растений.

Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы заметили, что он успешно применяется к клеточным линиям дрожжей и млекопитающих. Изолируйте протопласты мезофил листьев арабидопсиса для двух разных образцов, как описано в текстовом протоколе. Держите контрольный образец, который не будет сшитым ультрафиолетовым излучением или образцом без CL, на льду.

Перенесите суспензию протопластов для сшивки, или CL-образец в большую чашку Петри. Добавьте в чашку 30 миллилитров ледяного раствора MMG, чтобы покрыть поверхность, и распределите клетки с помощью аккуратного пипетирования. При транспортировке чашку Петри накрываем алюминиевой фольгой к УФ-сшивающему аппарату.

Немедленно поместите открытую чашку Петри в УФ-сшивающий аппарат. Следите за тем, чтобы расстояние между чашкой и УФ-лампой составляло восемь сантиметров, а затем облучайте образец в течение одной минуты. После этого быстро аликвотируйте суспензию протопластов из чашки Петри в две новые 50-миллилитровые трубки с круглым дном.

Вымойте дно посуды еще пятью миллилитрами ледяного раствора MMG, чтобы собрать остатки протопластов. Разделите суспензию между двумя трубками. Затем центрифугируйте пробирки для образцов без CL и две пробирки с CL при 100-умножденной g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

После удаления надосадочной жидкости поместите пробирку с гранулой без CL обратно на лед. Добавьте 10 миллилитров ледяного раствора MMG в каждую пробирку с образцом CL и осторожно встряхните пробирки, чтобы повторно суспендировать гранулы. Объединив два образца в одну 50-миллилитровую пробирку с круглым дном, центрифугируйте при 100-кратном g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Выбросив надосадочную жидкость, держите гранулу на льду. Затем добавьте девять миллилитров ледяного буфера, связывающего лизис, к клеточной грануле каждого образца. Лизируйте протопласты путем пипетирования вверх и вниз примерно двадцать раз, пока раствор не приобретет однородный светло-зеленый цвет.

Для гомогенизации лизат протопластов дважды пропустить через стеклянный шприц объемом 50 миллилитров с узкой иглой, а затем выдержать лизат на льду в течение десяти минут. Заморозьте образцы в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до трех недель. После размораживания пробирки с замороженным лизатом протопластов при комнатной температуре, держите пробирку на льду.

Распределите 1,8 миллилитра олиго-d(T)магнитных шариков в шесть новых двухмиллилитровых микроцентрифужных пробирок с круглым дном, помещенных на лед. Промойте суспензию шариков в каждой пробирке 600 микролитрами буфера, связывающего лизис, кратковременно пипетируя вверх и вниз, и осторожно вращайте шарики на ротаторе в течение двух минут. Держите бусины на льду.

Затем поместите все шесть трубок с шариками в магнитный штатив по крайней мере на три минуты, чтобы дать достаточно времени для полного магнитного захвата. Когда бусины будут полностью захвачены, суспензия станет прозрачной. Затем выбросьте надосадочную жидкость из всех шести пробирок и сразу же залейте в них девять миллилитров лизата протопластов.

Смешайте шарики с лизатом пипетированием до тех пор, пока суспензия не станет коричневой и однородной. Инкубируйте пробирки при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа с легким вращением. После инкубации поместите пробирки обратно в магнитную решетку на три минуты.

Когда все шарики будут захвачены на боковых сторонах пробирок, соберите надосадочную жидкость, содержащую лизат протопласта, в шесть новых двухмиллилитровых микроцентрифуг с круглым дном. Затем добавьте 1,5 миллилитра ледяного промывочного буфера по одному в каждую пробирку, содержащую шарики, и повторно суспендируйте шарики с помощью пипетирования. После осторожного вращения в течение одной минуты поместите пробирки обратно в магнитную решетку на три минуты.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторите этот этап стирки один раз. Используя 1,5 миллилитра ледяного буфера для стирки, повторите одну и ту же процедуру стирки дважды. Если mRNP были эффективно выделены из лизата протопласта, то в образце CL вокруг гранулы должен быть виден ореол.

Наконец, повторите процедуру умывания один раз с 1,5 миллилитрами ледяного буфера с низким содержанием соли. После промывки добавьте 500 микролитров элюирующего буфера в каждую трубку и аккуратно повторно суспендируйте шарики с помощью пипетирования. Инкубируйте при температуре 50 градусов Цельсия в течение трех минут, чтобы высвободить поли-А хвостатые РНК.

Аккуратно повторно подвесьте бусины с помощью пипетирования один раз и поместите пробирки обратно в магнитный штатив при температуре четыре градуса Цельсия на пять минут. Перенесите и соедините элюенты из всех шести пробирок в 15-миллилитровую пробирку с коническим дном, помещенную на лед. Это даст примерно три миллиметра элюента.

Качество и количество РНК можно сразу определить с помощью спектрофотометра. Подготовьте шарики oligo-d(T) для повторного использования, дважды промыв их одним миллилитром ледяного буфера для элюирования. После этого промойте их одним миллилитром ледяного буфера для связывания лизиса, чтобы довести концентрацию соли до 500 миллимоляров.

Используйте эти промытые шарики oligo-d(T) для повторения процедур связывания, промывки и элюирования в течение еще двух раундов. Это истощит поли-А хвостатые РНК из лизата протопласта и даст в общей сложности девять миллиметров элюента для каждого образца. Бусины можно хранить и использовать для другого эксперимента максимум три раза.

Чтобы проверить качество РНК, расщепите УФ-сшитые белки раствором протеиназы К в соответствии с текстовым протоколом. Затем очистите РНК с помощью набора для очистки РНК, чтобы удалить любые остаточные загрязнения. После очистки образцы готовы к тестированию качества РНК с помощью qRT-PCR.

Начните с обработки восьми миллилитров каждого образца 100 единицами коктейля РНКазы, содержащего РНКазу А и РНКазу Т1. После краткого вортекса инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Чтобы концентрировать мРНК-связывающие белки, или mRBP, отфильтруйте образцы с помощью центробежных фильтров. Каждый образец даст 75 микролитров с двумя микрограммами белка.

Для длительного хранения заморозьте образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы запустить гель на странице SDS, смешайте 25 микролитров каждого концентрированного образца с 15 микролитрами 2-кратного загрузочного красителя и нагрейте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Загрузите образцы в белковый маркер на гель SDS-страницы с пятипроцентным стекирующим гелем и двенадцатипроцентным разрешающим гелем.

Далее дважды смойте гель сверхчистой водой в течение пяти минут за одно мытье. Используйте коммерческий набор для окрашивания геля, чтобы окрашивать гель. Если было использовано достаточное количество исходных протопластов, белковые полосы проявятся в течение пяти минут.

Для дальнейшего тестирования mRBP очистите пептиды от второго геля 1D-страницы, как описано в текстовом протоколе. Эти очищенные пептиды теперь могут быть проанализированы с помощью нано-обратной фазовой жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии, а также качественной и количественной протеомики. После захвата олиго-d(T)шариков кОТ-ПЦР продемонстрировала значительно более высокие уровни полиубиквитина 10 референсной мРНК по сравнению с 18S рРНК.

Поскольку олиго-d(T)шарики связываются только с поли-А хвостатой РНК, это говорит о том, что мРНК обогащены элюентом. Захват mRBP с помощью олиго-d(T)шариков дополнительно оценивается с помощью окрашенного серебром геля SDS-страницы. Гель показывает значительно большее количество белка в образце УФ-сшитого CL по сравнению с образцом без сшитого CL.

Продолжительность ультрафиолетового облучения может влиять на эффективность сшивки. Этот окрашенный серебром гель SDS подтверждает, что одна или три минуты ультрафиолетового облучения являются оптимальным условием с самой высокой интенсивностью полосы. В общей сложности 325 белков были идентифицированы с помощью количественного протеомного анализа.

225 из этих белков были ниже уровня значимости из-за низкого количества пептидов, присутствующих для каждого белка, с высокой вариабельностью интенсивности пептидов. Однако, поскольку все они были качественно обнаружены только в образцах CL, все они были признаны положительными. Эти 325 белков были далее классифицированы на три категории: рибосомные белки, основные RBP и кандидаты RBP.

У кандидатов RBP отсутствуют традиционные РНК-связывающие домены, и большинство их ролей не были подтверждены, что предполагает возможные новые функции в регуляции РНК. После освоения этой техники ее можно выполнить за одну неделю при правильном выполнении. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области путей молекулярной регуляции у растений к изучению полногеномного протеома, связанного с матричной РНК в клетках и тканях двудольных и однодольных растений.