Плазменная ПЦР с высоким разрешением для рецептора комплемента 1 Полиморфизм длины генотипа Генотипирование: инновационный инструмент для оценки чувствительности генов к болезням Альцгеймера

Общая цель данного метода заключается в том, чтобы генотипировать полиморфизмы рецептора 1 длины для использования при оценке восприимчивости к заболеваниям, таким как болезнь Альцгеймера, чтобы лучше понять роль изоформ CR1 в патогенезе заболевания. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как патогенез болезни Альцгеймера. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он не требует свежих образцов крови и это проще, дешевле, быстрее и, следовательно, применимо для больших групп населения.

Идея этого метода возникла у нас, когда мы осознали трудности при проведении вестерн-блоттинга, связанные с необходимым временем и потребностью в свежих образцах крови. Пипеткой введите 20 микролитров протеиназы К на дно 1,5-миллилитровой пробирки. Затем добавьте в пробирку 200 микролитров образца.

Добавьте в образец 200 микролитров буфера для лизиса. Перемешивайте путем импульсного вортекса в течение 15 секунд. После смешивания выдерживать при температуре 56 градусов Цельсия в течение 10 минут на водяной бане.

Кратковременно центрифугируйте 1,5-миллилитровую пробирку, чтобы удалить капли с внутренней стороны крышки. Затем добавьте в пробу 100 микролитров этанола. Снова перемешайте путем импульсного вихревого нагревания в течение 15 секунд, прежде чем кратковременно центрифугировать пробирку, как и раньше.

Далее аккуратно нанесите смесь на мембранный столбик в двухмиллилитровую сборную пробирку. Не смачивая ободок, закройте крышку и центрифугируйте при 6 000 G в течение одной минуты. Поместите мембранный столбик в чистую двухмиллилитровую сборную пробирку и выбросьте пробирку, содержащую фильтрат.

Аккуратно откройте мембранный столбик и добавьте 500 микролитров промывочного буфера одного, не смачивая обод. Закройте крышку и центрифугуйте при температуре 6 000 раз G на одну минуту. Затем поместите мембранную колонку в чистую двухмиллилитровую пробирку для сбора и выбросьте пробирку, содержащую фильтрат.

После осторожного вскрытия мембранной колонки добавьте 500 микролитров промывочного буфера два, не смачивая обод. Закройте крышку и центрифугируйте при температуре 20 000 раз G в течение трех минут. Затем поместите мембранную колонку в новую двухмиллилитровую сборную пробирку и снова центрифугуйте.

После центрифугирования поместите мембранную колонку в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра и выбросьте сборную трубку, содержащую фильтрат. Осторожно откройте мембранный столбик и добавьте 200 микролитров дистиллированной воды. Инкубируйте колонку при комнатной температуре в течение пяти минут перед центрифугированием при 6000 G в течение одной минуты.

Чтобы выполнить протокол HRM-ПЦР, сначала разведите образцы ДНК в 1,5-миллилитровых пробирках с водой до концентрации 10 нанограммов на микролитр. Далее разведите размороженные растворы грунтовки в 1,5-миллилитровых пробирках с водой до той же концентрации шести микромоляров. Разморозьте растворы наборов HRM-PCR и тщательно перемешайте путем вортексирования, чтобы обеспечить восстановление всего содержимого.

Перед открытием на короткое время закрутите три флакона, содержащие ферментативную смесь с ДНК-связывающим красителем, хлоридом магния и водой, в микроцентрифуге. В 1,5-миллилитровой пробирке комнатной температуры используйте компоненты для приготовления ПЦР-смеси для 120-микролитровой реакции, как описано в текстовом протоколе. Тщательно перемешайте вортексом.

Очень важно, чтобы вы работали с вниманием и усердием в соответствии с передовой практикой молекулярной биологии. Пипеткой по 19 микролитров смеси для ПЦР в каждую лунку белого многолуночного планшета. Добавьте один микролитр матрицы ДНК с отрегулированной концентрацией, затем запечатайте белую многолуночную пластину герметизирующей фольгой.

Центрифугируйте белый многолуночный планшет в течение одной минуты при перегрузке 1,500 G в стандартной центрифуге с поворотным ведром, содержащей ротор для многолуночных планшетов с подходящими адаптерами. Загрузите белый многолуночный планшет в прибор HRM-PCR. Запустите программу HRM-PCR с условиями ПЦР, найденными в текстовом протоколе.

После реакции HRM-ПЦР выполните анализ HRM для определения полиморфизма длины CR1, как описано в текстовом протоколе. Фьюжн-кривые были проанализированы с помощью программного обеспечения после плавления ампликонов, полученных методом ПЦР, с высоким разрешением из геномной ДНК субъектов с различными изоформами CR1. В результате получаются кривые, которые дискриминируют субъектов в соответствии с их аллотипическими фенотипами экспрессии CR1.

Как показано на примере двух способов представления, нормализованных и сдвинутых кривых плавления и нормализованного и смещенного по времени разностного графика, профили кривых распределены в соответствии с CR1 звездой три, CR1 звездой одной группой, CR1 звездой 1, CR1 звездой 1 группой один, CR1 звездой 2 и CR1 звездой 2. CR1 звездная четверка группа. Эти кривые соответствуют аллелям полиморфизма длины CR1. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как легко генотипировать полиморфизм длины CR1 по идеальным кривым, полученным с помощью HRM-ПЦР.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за потребности в эталонных образцах уже известных генотипов длины CR1. Когда эта техника будет освоена, ее можно сделать за четыре часа, если она будет выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об использовании одной и той же концентрации для каждого образца ДНК.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как коническое секвенирование ДНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как обнаружение нового известного частного SNP. После этого развития этот метод открывает путь для исследований в области популяционной генетики для изучения селективного давления патогенов в полиморфизме длины CR1. Хотя этот метод может дать представление о предрасположенности в патогенезе болезни Альцгеймера, он также может быть применен к другим исследованиям заболеваний, таких как системная красная волчанка и малярия.