Метод на основе фильтрации на основе высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы для иммунопреципитации хроматина

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы обеспечить получение высококачественных ядер из сшитых скелетных мышц, которые затем могут быть использованы для исследований иммунопреципитации хроматина. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мышц и циркадных ритмов, такие как геномные исследования с использованием мышечных тканей и клеток в циркадном или другом чувствительном ко времени контексте. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет немедленно сшивать образцы, а также может быть надежно проведена процедура, основанная на фильтрации, для выделения высококачественных ядер с минимальным загрязнением миофибриллами.

Хотя этот метод может дать представление о скелетных мышцах, он также может быть применен к другим системам, таким как сердечная и гладкая мускулатура. Взвесьте и измельчите скелетные мышцы задних конечностей, выделенные у примерно 20-недельных черных мышей C57 из шести самцов в ледяном солевом буфере, как описано ранее. Поместите измельченную скелетную мышечную ткань в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 10 миллилитров PBS на льду.

Затем центрифугируйте образец при 300-кратном g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость PBS путем аспирации. Оцените объем гранул в каждой 50-миллилитровой трубке с помощью контрольных трубок с одним, двумя, тремя и четырьмя миллилитрами воды.

Добавьте семь объемов ледяного 1%-ного формальдегида и PBS и гомогенизируйте образцы на льду с помощью зондового гомогенизатора тканей. Далее сшивают образец, инкубируя его при комнатной температуре в течение 10 минут. Погасить реакцию сшивания путем добавления одного моляра глицина до конечной концентрации 0,125 моляра с последующей инкубацией в течение пяти минут при комнатной температуре.

После центрифугирования образца при 3000-кратном g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия удалите надосадочную жидкость с помощью аспирации. Промойте гранулу, восстановив ее в 10 миллилитрах ледяного базового буфера, содержащего свежедобавленные ингибиторы протеазы. Снова центрифугируйте образец и осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации.

Затем повторно суспендируйте гранулу в шести миллилитрах лизисного буфера, содержащего свежедобавленные ингибиторы протеазы. Переложите образец в предварительно охлажденный гомогенизатор Dounce объемом 15 миллилитров и инкубируйте в течение 10 минут на льду. Dounce: Гомогенизируйте каждый образец на льду 15 медленными движениями с помощью рыхлого пестика, а затем 15 ударами тугим пестиком для высвобождения ядер.

Следующие этапы фильтрации являются ключом к выделению высококачественных ядер. Отфильтруйте гомогенат через клеточное ситечко и промойте четырьмя миллилитрами буфера для лизиса. Затем центрифугируйте образцы при 1000 умноженных на g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах ледяного базового буфера и снесите 10 раз тугим пестиком, чтобы освободить ядра. Затем процедите суспензию через сетчатое фильтр и промойте пробирку двумя миллилитрами базового буфера и снова отфильтруйте. Повторите фильтрацию с помощью клеточных фильтров с постепенно уменьшающимися порами.

Наконец, центрифугируйте при 1000 g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах базового буфера перед повторным центрифугированием. Выбросьте надосадочную жидкость и храните гранулу при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Разморозьте образцы в 500 микролитрах буфера для лизиса SDS и ресуспендируйте с помощью щадящего пипетирования. Перенесите суспензию ядер ДНК в стеклянный флакон со льдом. Выбор правильной платформы и условий ультразвука имеет решающее значение для получения хроматина из изолированных ядер.

Запустите ультразвуковую обработку с помощью сфокусированных всплесков ультразвуковой акустической энергии от дискообразного преобразователя, используя настройки, описанные в текстовом протоколе. Перенесите обработанный ультразвуком хроматин в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем центрифугируйте при 12 000 раз g в течение 15 минут и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку.

Затем перелейте 50 микролитров образца, обработанного ультразвуком, в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра для обратного сшивания на ночь при температуре 65 градусов Цельсия. Сбор образцов ДНК описан в следующем разделе. После оценки ультразвуком и количественного определения, как описано в текстовом протоколе, аликвотируйте размороженный хроматин примерно до 100-120 микрограммов на пробирку.

Затем разбавьте хроматин один к 10 иммунопреципитационным буфером. Затем добавьте 40 микролитров 50% суспензии предварительно заблокированного белка BSA агарозы или шариков IgY и инкубируйте на ротаторе в течение трех часов при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования образца при 1000 раз g в течение 10 минут осторожно перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки.

Затем добавьте антитела по одному микрограмму антитела на 25-100 микрограммов хроматиновой ДНК. Осторожно вращайте в течение ночи со скоростью четыре градуса Цельсия и примерно 15 оборотов в минуту. Затем добавьте 10 микролитров предварительно заблокированного BSA белка агарозы или IgY и перемешайте.

Вращайте бусинную суспензию в холодном помещении в течение двух часов. Затем промойте шарики буфером RIPA, а затем буфером с высоким содержанием соли, буфером хлорида лития и Tris EDTA, как подробно описано в текстовом протоколе. После промывки вымывайте ДНК из шариков, сначала центрифугируя при 1000 g в течение одной минуты и осторожно удаляя надосадочную жидкость.

Суспендируйте шарики 50 микролитрами элюирующего буфера. Затем выдерживать в течение 10 минут при температуре 65 градусов Цельсия. После инкубации центрифугируйте при 12 000 раз g в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость и добавьте еще 50 микролитров элюирующего буфера, прежде чем снова центрифугировать при 12 000 г в течение пяти минут. Итоговый объем элюирования составит 100 микролитров. Чтобы выполнить обратное сшивание и элюирование ДНК, сначала инкубируйте элюированный хроматин в течение ночи при температуре 65 градусов Цельсия.

Затем добавьте один микролитр РНКазы А перед инкубацией в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Впоследствии инкубируйте с восемью микролитрами 10 мг на миллилитр протеазы К в течение 30 минут при температуре 55 градусов Цельсия. Забор ДНК осуществляется с помощью набора для очистки ПЦР с объемом элюирования 50 микролитров согласно протоколу производителя.

Наконец, проанализируйте профили с помощью QPCR в реальном времени, как описано ранее. Последовательная фильтрация эффективно удаляет остатки тканей. Здесь приведены репрезентативные изображения образцов после первичной фильтрации и после серийной фильтрации для сравнения.

Постепенное расщепление хроматина в течение 10 циклов ультразвука выявляется путем введения агарозного геля. 10 циклов ультразвука с расщепленным хроматином привели к образованию ДНК, состоящей примерно из 500 пар оснований. Здесь показаны репрезентативные результаты QPCR для самцов B с одним CHIP с образцами скелетных мышц мыши, собранными на ZT6 и ZT18.

Анализ элементов расположения Dbp в гене Dbp показал, что в соответствии с предыдущими результатами пики связывания находятся примерно на уровне ZT6. После освоения подготовка ядер может быть выполнена за пять-шесть часов, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать методы фильтрации для очистки высококачественных ядер и хроматиновой ДНК из сшитой мышечной ткани.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о хранении образцов на льду или в холодном помещении и сохранять аликвоты образцов для микроскопической проверки до и после этапов фильтрации. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области мышц и геномики к изучению циркадной или чувствительной ко времени динамики взаимодействия хроматина и белка в различных мышечных тканях. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование CHIP, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как поиск паттернов связывания транскрипционного фактора в мышечных тканях.