Метод на основе фильтрации на основе высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы для иммунопреципитации хроматина

Общая цель данной экспериментальной процедуры — подготовка высококачественных ядер из сшитых тканей скелетных мышц, которые в дальнейшем могут быть использованы для исследований методом иммунопреципитации хроматина. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области изучения мышц и циркадных ритмов, например, при проведении геномных исследований мышечных тканей и клеток в циркадном или другом чувствительном ко времени контексте. Основным преимуществом данной методики является возможность немедленного сшивания образцов, а процедура на основе фильтрации позволяет надежно изолировать высококачественные ядра с минимальным загрязнением миофибриллами.

Хотя данный метод позволяет получить представление о скелетных мышцах, его также можно применять к другим системам, таким как сердечные мышцы и гладкие мышцы. Взвесьте и измельчите скелетные мышцы задних конечностей, выделенные из шести самцов мышей линии C57 black six в возрасте примерно 20 недель, в ледяном фосфатно-солевом буферном растворе, как описано ранее. Поместите измельченную ткань скелетных мышц в коническую пробирку объемом 50 milliliter, содержащую 10 milliliters PBS на льду.

Затем центрифугируйте образец при 300 ×g при температуре четыре °C в течение пяти минут. Осторожно удалите супернатант PBS путем аспирации. Оцените объем осадка в каждой пробирке объемом 50 мл, используя контрольные пробирки с одним, двумя, тремя и четырьмя мл воды.

Добавьте семь объемов ледяного 1% формальдегида и PBS, затем гомогенизируйте образцы на льду с помощью тканевого гомогенизатора с погружным зондом. Далее проведите сшивку образца путем инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Остановите реакцию сшивки, добавив глицин 1 M до конечной концентрации 0,125 M, после чего инкубируйте смесь в течение пяти минут при комнатной температуре.

После центрифугирования образца при 3 000 ×g в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия удалите супернатант путем аспирации. Промойте осадок, ресуспендировав его в 10 миллилитрах ледяного базового буфера, содержащего свежедобавленные ингибиторы протеаз. Снова центрифугируйте образец и осторожно удалите супернатант путем аспирации.

Затем ресуспендируйте осадок в 6 мл лизирующего буфера с недавно добавленными ингибиторами протеаз. Перенесите образец в предварительно охлажденный гомогенизатор Даунса объемом 15 мл и инкубируйте в течение 10 минут на льду. Проведите гомогенизацию каждого образца на льду, используя сначала 15 медленных движений пестиком с неплотным прилеганием, а затем 15 движений пестиком с плотным прилеганием для высвобождения ядер.

Следующие этапы фильтрации являются ключевыми для выделения высококачественных ядер. Профильтруйте гомогенат через клеточный фильтр (cell strainer) и промойте четырьмя миллилитрами лизирующего буфера. Затем центрифугируйте образцы при 1 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C.

Ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах ледяного базового буфера и 10 раз гомогенизируйте с помощью плотного пестика в гомогенизаторе Dounce для высвобождения ядер. Затем профильтруйте суспензию через фильтр для клеток, промойте пробирку двумя миллилитрами базового буфера и профильтруйте повторно. Повторяйте фильтрацию, используя фильтры для клеток с постепенно уменьшающимся размером пор.

В завершение центрифугируйте при 1 000 ×g при температуре 4 °C в течение 10 минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 500 µL базового буфера перед повторным центрифугированием. Удалите супернатант и храните осадок при температуре -80 °C.

Разморозьте образцы в 500 µL буфера для лизиса SDS и ресуспендируйте путем осторожного пипетирования. Перенесите суспензию ДНК ядер в стеклянный флакон на льду. Выбор подходящей платформы и режима соникации имеет решающее значение для подготовки хроматина из изолированных ядер.

Выполните соникацию с использованием сфокусированных импульсов ультразвуковой акустической энергии от дискообразного преобразователя согласно настройкам, указанным в текстовом протоколе. Перенесите соникационный хроматин в пробирку объемом 1,5 мл. Затем центрифугируйте при 12 000 ×g в течение 15 минут и перенесите супернатант в новую пробирку.

Затем перенесите 50 µL обработанного ультразвуком образца в новую пробирку объемом 1,5 mL для обратного сшивания в течение ночи при 65 °C. Сбор образцов ДНК описан в следующем разделе. После оценки эффективности соникации и количественного анализа, согласно текстовому протоколу, разделите размороженный хроматин на аликвоты примерно по 100–120 µg на пробирку.

Затем разведите хроматин в соотношении 1:10 буфером для иммунопреципитации. Далее добавьте 40 µL 50% суспензии BSA-блокированного белка HE-агарозы или бусин IgY и инкубируйте на ротаторе в течение трех часов при 4 °C. После центрифугирования образца при 1 000 ×g в течение 10 минут осторожно перенесите супернатант в новые пробирки.

Затем добавьте антитела из расчета 1 µg антител на 25–100 µg хроматиновой ДНК. Оставьте для осторожного перемешивания в течение ночи при 4 °C и скорости примерно 15 об/мин. Затем добавьте 10 µL предварительно заблокированного BSA белкового агароза-HE или бусин IgY и перемешайте.

Перемешивайте суспензию гранул в холодильной комнате в течение двух часов. Затем промойте гранулы буфером RIPA, после чего используйте буфер с высоким содержанием солей, буфер хлорида лития и Tris EDTA, как подробно описано в текстовом протоколе. После промывки элюируйте ДНК с гранул, предварительно центрифугируя смесь при 1, 000 ×g в течение одной минуты и осторожно удалив супернатант.

Ресуспендируйте гранулы в 50 µL элюирующего буфера. Затем инкубируйте в течение 10 минут при 65 °C. После инкубации центрифугируйте при 12 000 ×g в течение пяти минут.

Удалите супернатант и добавьте еще 50 µL буфера для элюции, после чего снова центрифугируйте при 12 000 ×g в течение пяти минут. Конечный объем элюата составит 100 µL. Для разрыва перекрестных связей и элюции ДНК сначала инкубируйте элюированный хроматин в течение ночи при 65 °C.

Затем добавьте один микролитр RNase A и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C. После этого инкубируйте с восьмью микролитрами протеиназы K в концентрации 10 мг/мл в течение 30 минут при 55 °C. Выделите ДНК, используя набор для очистки ПЦР-продуктов с объемом элюции 50 мкл согласно протоколу производителя.

Наконец, проанализируйте профили с помощью ПЦР в реальном времени по ранее описанному методу. Последовательная фильтрация эффективно удалила тканевые остатки. Для сравнения здесь представлены репрезентативные изображения образцов после первичной и после серийной фильтрации.

Постепенная фрагментация хроматина в результате 10 циклов соникации подтверждается путем проведения электрофореза в агарозном геле. 10 циклов соникации переваренного хроматина привели к получению фрагментов ДНК размером примерно 500 п. н. Здесь представлены репрезентативные результаты QPCR для B males one chIP с образцами скелетных мышц мыши, собранными в моменты ZT6 и ZT18.

Анализ элементов локализации Dbp в гене Dbp показал, что, в соответствии с предыдущими результатами, пики связывания наблюдаются примерно в ZT6. После освоения методики подготовка ядер может быть выполнена за пять-шесть часов при правильном соблюдении процедуры. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать методы на основе фильтрации для очистки высококачественных ядер и хроматиновой ДНК из сшитых тканей мышц.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости содержания образцов на льду или в холодильной комнате, а также о сохранении аликвот образцов для микроскопического контроля до и после этапов фильтрации. После разработки этот метод открыл исследователям в области мышечной ткани и геномики возможность изучать циркадные или зависящие от времени динамические процессы взаимодействия хроматина и белков в различных мышечных тканях. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как ChIP-секвенирование, для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, для выявления паттернов связывания транскрипционных факторов в мышечных тканях.