Количественная иммуногистохимия клеточного микроокружения при резекции глиобластомы пациента

Общая цель данного протокола заключается в количественной идентификации компонентов микроокружения опухоли в резекциях глиобластомы пациентов с использованием хромогенной иммуногистохимии и программы Image J. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроокружения опухолей, например, о том, как выглядят эти компоненты в образцах пациентов и как можно определить физиологически значимые соотношения клеток. Главным преимуществом данной методики является простота анализа образцов пациентов. Применение этого метода способствует более детальному изучению недостаточно охарактеризованного и сложного микроокружения опухоли при глиобластоме.

Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку время хромогенного проявления требует строгого контроля для предотвращения избыточного проявления и насыщения ткани. Начните выполнение протокола с промывок, указанных в сопроводительном текстовом описании. Разведите раствор для демаскировки антигенов с высоким pH на основе Трис и дистиллированную воду в соответствии с рекомендациями производителя.

Переходите к термически индуцированной демаскировке антигенов, добавив разведенный раствор для демаскировки в незакрытый сосуд, подходящий для использования в микроволновой печи. Поместите предметные стекла в сосуд. Затем установите сосуд со стеклами в микроволновую печь.

Затем кипятите содержимое сосуда в течение 20 минут на высокой мощности. Следите за уровнем жидкости, чтобы избежать пересыхания, и при необходимости доливайте в сосуд дистиллированную воду. Оставьте образцы охлаждаться в растворе в течение одного часа при комнатной температуре.

Обведите образец ткани гидрофобным маркером, чтобы минимизировать объем реагентов, необходимых для покрытия образца. Затем с помощью пипетки внесите достаточное количество раствора для пермеабилизации, от 100 до 200 µL, чтобы полностью покрыть образец ткани. Удалите и утилизируйте раствор, после чего снова покройте образец ткани раствором для пермеабилизации.

Инкубируйте образцы при комнатной температуре с блокирующим раствором в течение одного часа. Затем инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 °C с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе. На следующий день проведите детекцию первичных антител с помощью полимерного реагента с пероксидазой хрена, соответствующего виду животного, в котором были получены первичные антитела.

С помощью пипетки добавьте достаточное количество раствора для пермеабилизации, чтобы полностью покрыть образец ткани, и инкубируйте его в течение пяти минут. Удалите и утилизируйте раствор, затем повторно залейте образец ткани раствором для пермеабилизации на пять минут. Инкубируйте предметные стекла в 0.3% перекиси водорода и IX TBS в течение 15 минут.

Проявите образцы с использованием субстрата пероксидазы диаминобензидина или dab в течение от 2 до 10 минут до достижения желаемой интенсивности окрашивания. Проведите докрашивание образцов для идентификации клеточных ядер, например, гематоксилином согласно протоколу производителя. Дегидратируйте образцы 100% этанолом и ксилолом.

Наконец, зафиксируйте образцы с помощью среды для заключения. Два интересующих региона в наших резекциях опухоли — основной массив опухоли (Bulk) и прилегающие области (Adjacent), состоящие преимущественно из здоровой ткани с диффузно инвазировавшими раковыми клетками, были определены collaborating neuropathologist на образцах пациентов, окрашенных гематоксилином и эозином. Хромогенная иммуногистохимия выявила положительное окрашивание астроцитов, микроглии и олигодендроцитов в каждом образце пациента.

Для отрицательного контроля мы провели окрашивание без первичных антител. Производитель рекомендовал дополнительные разведения, прежде чем было выбрано разведение 1:200, которое обеспечило оптимальное положительное окрашивание тел и отростков клеток при минимальном фоновом шуме для антител к ALDH 1l1. С помощью программы Image J была количественно определена степень покрытия OSP-1-положительного окрашивания олигодендроцитов для последующего сравнения различий в исследуемых областях.

После применения подходящего порога к изображению можно измерить и сравнить процент покрытия по этому порогу для нескольких пациентов. Было проведено сравнение пяти прилегающих и объемных областей образцов глиобластомы или GBM пациентов, а также здоровой ткани мозга по проценту покрытия специфического белка олигодендроцитов 1 или OSP1. При должном исполнении и наличии соответствующего навыка техника окрашивания занимает четыре часа в первый день и два часа во второй день.

При выполнении данной процедуры важно внимательно следить за интенсивностью окрашивания и гидратацией ткани.