Количественная иммуногистохимия клеточного микроокружения при резекции глиобластомы пациента

Общая цель этого протокола заключается в количественной идентификации компонентов микроокружения опухоли при резекции пациента с глиобластомой с использованием хромогенной иммуногистохимии и изображения J. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроокружения опухоли, например, как эти компоненты выглядят в образцах пациентов и как мы можем определить физиологически значимые соотношения клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она проста для анализа в образцах пациентов. Применение этого метода распространяется на выяснение недостаточно охарактеризованного, сложного микроокружения опухоли глиобластомы.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что время хромогенного развития необходимо тщательно контролировать, чтобы предотвратить чрезмерное развитие и насыщение ткани. Начните протокол с выполнения промывок, указанных в сопроводительном текстовом протоколе. Разбавить демаскирующий раствор антигена высокого pH на основе триса и дистиллированную воду в соответствии с рекомендациями производителя.

Перейдите к извлечению антигена, опосредованного нагреванием, добавив разбавленный демаскирующий раствор в негерметичный сосуд для микроволновой печи. Поместите в сосуд горки. Затем поместите сосуд с горками в микроволновую печь.

Далее прокипятите сосуд в течение 20 минут на высокой мощности. Следите за уровнем испарения жидкости и при необходимости пополняйте емкость дистиллированной водой. Дайте образцам остыть в растворе в течение одного часа при комнатной температуре.

Обведите образец ткани гидрофобным средством, чтобы свести к минимуму объем реагентов, необходимых для покрытия образца. Затем нанесите достаточное количество раствора для пермеабилизации, от 100 до 200 микролитров, чтобы покрыть образец ткани. Удалите и выбросьте раствор и снова покройте образец ткани раствором для пермеабилизации.

Инкубируйте образцы при комнатной температуре с блокирующим раствором в течение одного часа. Затем инкубируйте образцы в течение ночи при четырех градусах Цельсия с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе. На следующий день обнаруживают первичные антитела с помощью полимерного реагента пероксидазы хрена, соответствующего животному-хозяину с первичным антителом.

Нанесите внутрь достаточное количество раствора для пермеабилизации, чтобы покрыть образец ткани, и инкубируйте образец в течение пяти минут. Удалите и выбросьте раствор и покройте образец ткани раствором для пермеабилизации еще раз на пять минут. Инкубируйте предметные стекла в 0,3%-ной перекиси водорода и IX TBS в течение 15 минут.

Проявляйте образцы с помощью пероксидазы диаминобензидина или субстрата dab в течение двух-10 минут до достижения желаемой интенсивности окрашивания. Для идентификации ядра клеток проведите контрокрашивание образцов, например, гематоксилином, следуя протоколу производителя. Обезвоживайте образцы с помощью 100% этанола и ксилола.

Наконец, закрепите образцы на постоянной основе с помощью монтажного носителя. Две области, представляющие интерес в наших резекциях опухолей, первичная опухоль Bulk и прилегающие области, в основном состоящие из здоровой ткани с диффузными вторгшимися раковыми клетками, были идентифицированы сотрудничающим невропатологом на образцах пациентов, окрашенных гематоксилином и эозином. Хромогенная иммуногистохимия выявила положительное окрашивание астроцитов, микроглии и олигодендроцитов в каждом образце пациента.

Мы проводили окрашивание без первичных антител для отрицательного контроля. Производитель рекомендовал дальнейшие разведения, прежде чем остановиться на разведении от 1 до 200 в связи с оптимальным положительным окрашиванием клеточного тела и процессом с минимальным фоном для антитела против ALDH 1l1. Используя изображение J, был количественно определен процент покрытия OSP-1 положительным окрашиванием олигодендроцитов, чтобы в конечном итоге сравнить различия в интересующих нас регионах.

После того, как соответствующий порог был применен к изображению, процент покрытия от порога может быть измерен и сравнен для нескольких пациентов. Пять смежных и объемных областей образцов пациентов с глиобластомой или ГБМ, а также здоровая ткань мозга сравнивались на предмет покрытия первого белка, специфичного для олигодендроцитов, или процентного охвата OSP1. После освоения техника окрашивания может быть выполнена за четыре часа в первый день и за два часа во второй день, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательном контроле интенсивности окрашивания тканей и увлажненности.