Лазерная допплеровская: Инструмент для измерения поджелудочной островок микрососудистой Vasomotion In Vivo

Общая цель данной процедуры заключается в определении функционального состояния микрососудистой вазомоторики островков поджелудочной железы in vivo для оценки её влияния на соответствующие заболевания. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области медицинской циркуляции, например, изменяется ли микрососудистая вазомоторика островков поджелудочной железы при патологических состояниях. Идея этого метода возникла у нас после того, как мы продемонстрировали наличие функциональной микроциркуляции, которая эволюционирует при развитии диабета.

Основным преимуществом данного метода является возможность оценки функционального состояния микрососудистой вазомоторики тканей и органов как в клинических, так и в лабораторных условиях. Этот метод позволяет получить представление о заболеваниях, связанных с островками поджелудочной железы. Его также можно применять к другим системам, например, при микрососудистых заболеваниях почек и сетчатки.

Применение данного метода также распространяется на изучение характера тенденций в функциональном состоянии микрососудистой вазомоции. Как правило, лица, впервые осваивающие этот метод, сталкиваются с трудностями из-за огромных объемов академических данных о микроциркуляции, получаемых с помощью лазерной допплерометрии в ходе экспериментов. Необходимо помнить, что демонстрация этого метода имеет критическое значение, поскольку многие факторы могут отрицательно повлиять на точность сбора данных о микроциркуляции.

Данный протокол начинается с ежедневных инъекций STZ мышам в течение пяти дней подряд. Растворите STZ в натрий-цитратном буфере до рабочей концентрации 5 мг/мл. Затем введите препарат путем внутрибрюшинных инъекций, используя шприц объемом 1 мл и иглу 25-го калибра.

Мыши должны находиться на голодном режиме в течение четырех часов перед инъекцией, однако доступ к воде должен быть сохранен. Контрольным мышам вводите тот же объем чистого натрий-цитратного буфера. После проведения инъекций обеспечьте мышам доступ к обычному корму и 10% раствору сахарозы в воде.

После пятого дня инъекций STZ замените 10% раствор сахарозы обычной водой. Спустя девять дней измерьте уровень глюкозы в крови. Перед этим подвергните мышей шестичасовому голоданию при свободном доступе к воде.

Затем возьмите кровь из хвостовых вен и измерьте уровень глюкозы с помощью стандартного ручного глюкометра. Считайте диабетическими всех мышей, уровень глюкозы в крови которых превышает 200 milligrams per deciliter. Перед использованием аппарата лазерного доплера очистите оптические поверхности наконечника зонда и разъема зонда мягкой неабразивной тканью, после чего подключите кабель к порту прибора.

Далее соберите калибровочный стенд. Сначала дождитесь, пока хранящийся стандарт потока достигнет комнатной температуры. Это занимает около получаса.

Затем осторожно встряхните стандарт потока в течение 10 секунд и оставьте его на калибровочном основании на две минуты. Далее поднимите зажим максимально высоко и закрепите в нем зонд. Теперь медленно погрузите зонд в стандарт потока и зафиксируйте его с помощью держателей зонда.

Для продолжения приглушите свет в помещении и нажмите кнопку калибровки на аппарате лазерного допплера. Выберите рабочий канал, к которому подключен датчик, и запустите программу калибровки. Поместите анестезированную мышь в положение на спине на рабочую платформу и зафиксируйте её с помощью хирургического пластыря.

Затем стерилизуйте кожу живота 75% ethanol от шейной области до хвоста, после чего прикройте периферию области сухой марлевой салфеткой с отверстием диаметром три сантиметра в центре. Далее приподнимите кожу живота пинцетом и сделайте первый вертикальный разрез по срединной линии живота с помощью скальпеля или ножниц для кожи. Затем захватите подлежащую мышцу пинцетом и сделайте разрез для входа в брюшную полость.

Избегайте повреждения органов. Чтобы открыть брюшную полость, заложите кожу и подлежащие мышцы на грудную клетку, затем осторожно обнажите тело поджелудочной железы и селезенку с помощью тупоконечного пинцета. Теперь в программном обеспечении лазерного допплеровского аппарата создайте новый файл измерения, после чего настройте подключенные мониторы.

На вкладке «Общие» (general) установите длительность мониторинга в режим свободного хода (free run), а во вкладке монитора LDF используйте заводские настройки по умолчанию. Затем откройте диалоговое окно настройки дисплея и выберите соответствующие каналы. После этого настройте следующие параметры: источник данных для канала и метку, единицы измерения и цвет, затем нажмите «Далее» (next).

Затем в диалоговом окне информации о файле введите идентификационные данные об объекте и измерении, после чего снова нажмите «Next» для продолжения. Теперь настройка завершена, и появится окно измерения. Далее вручную переместите электрод так, чтобы он находился на расстоянии одного миллиметра от поджелудочной железы.

Точность измерения зависит от расстояния между зондом и тканью панкреатических островков. Показания кровотока будут недостоверными, если строго соблюдать зазор в 1 мм между тканями и зондом. Чтобы начать запись, нажмите значок «пуск», после чего начнется сохранение данных о микрососудистом кровотоке PU.

Выполняйте это действие в течение полной минуты, используя кнопки сжатия и расширения отображения, а также кнопки увеличения или уменьшения высоты графиков для настройки визуализации эффекта во время записи, после чего остановите запись. Затем сохраните файл под соответствующим именем. Теперь вручную переместите зонд, чтобы избежать аддитивных эффектов и локального истощения сократительной и релаксационной способности.

В общей сложности соберите данные PU в трех случайных точках поджелудочной железы для каждой мыши. В определенный момент эксперимента измерьте данные PU с нерефлекторной пластины, чтобы получить базовое контрольное значение. После проведения трех измерений используйте шовный материал 3-0 для ушивания мышечных слоев, а затем шовный материал 4-0 для ушивания кожи.

Теперь наблюдайте за мышью в клетке для восстановления до тех пор, пока она не будет готова к переносу в чистую домашнюю клетку. В целом, микроциркуляторное состояние островков поджелудочной железы характеризуется периодическими фазами сокращения и расслабления. Общие гемодинамические явления формируют определенный характер перфузии кровотока.

С помощью лазерного доплеровского аппарата были собраны данные PU для демонстрации паттерна распределения микроциркуляторной перфузии крови у мышей без сахарного диабета и с сахарным диабетом. Результаты существенно различались. Ритм сокращений и расслаблений микрососудистой вазомоции островков поджелудочной железы был хаотичным и нерегулярным у мышей с диабетом, индуцированным STZ, тогда как в контрольной группе мышей без диабета наблюдались ритмические осцилляции.

Затем была проведена количественная оценка вазомоции с использованием профилей PU. По сравнению с контрольной группой, средняя перфузия крови в микроциркуляции островков поджелудочной железы была снижена у мышей с диабетом, индуцированным STZ. У этих мышей также наблюдалось значительное снижение амплитуды и частоты данной вазомоции, а также относительной скорости перфузии крови в островках поджелудочной железы.

После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает 30 минут. При выполнении этой процедуры важно следить за тем, чтобы расстояние между датчиком и тканью поджелудочной железы не превышало 1 мм. Неправильно выбранное расстояние приводит к искусственному завышению или занижению показателей кровотока.

После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как анализ лазерного спекла и перемещение кислорода, для решения дополнительных задач, включая визуализацию ишемии, оценку кровотока и определение функционального состояния микрососудистой вазомоции. Разработка этого метода позволила исследователям и клиницистам в области эндокринологии и обмена веществ изучить микроциркуляторные механизмы, лежащие в основе заболеваний, связанных с островками поджелудочной железы. Помните, что работа с лазерным оборудованием может быть чрезвычайно опасна из-за воздействия излучения, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо соблюдать меры предосторожности, в том числе обеспечивать расстояние не менее 200 миллиметров от глаза до источника излучения.