Фаза поведение заряженных везикулы условиях симметричные и асимметричные решения, контролировать с микроскопии флуоресцирования

Общая цель данного протокола заключается в количественной оценке влияния сред с высокой соленостью и трансмембранной асимметрии раствора, обнаруженной в физиологических условиях, на фазовые состояния мембраны. Решения внутри и вне ячеек сильно отличаются. Наши методы помогают понять влияние асимметрии раствора на свойства мембраны и фазовое поведение.

Основное преимущество нашего подхода заключается в том, что везикулы могут быть подготовлены в физиологических буферных условиях, а микрофлюидное устройство может быть использовано для создания асимметричных буферных условий. Чтобы начать процедуру, придайте шероховатость одной стороне плиты из ПТФЭ мелкой наждачной бумагой. Вымойте тарелку, стеклянный флакон объемом 15 миллилитров и закрывающийся стеклянный контейнер с коммерческим средством для мытья посуды, этанолом и хлороформом.

С помощью стеклянного шприца объемом 25 микролитров нанесите от 10 до 15 микролитров липидного запаса в хлороформе на шероховатую сторону чистой сухой пластины из ПТФЭ. Распределите липидный запас иглой шприца, чтобы создать однородную липидную пленку. С помощью пинцета перенесите пластину в флакон объемом 15 миллилитров.

Нагрейте пластину до 60 градусов Цельсия и высушите в течение двух часов, чтобы растворитель испарился. Затем добавьте деионизированную воду в стеклянную емкость на высоту около одного сантиметра. Установите флакон с пластиной в контейнер, убедившись, что он остается устойчивым и вертикальным, и закройте контейнер.

Дайте липидному бислою предварительно набухнуть при температуре 60 градусов Цельсия в течение четырех часов. Затем достаньте флакон из контейнера. Наберите пять миллилитров набухающего раствора в пластиковый шприц и прикрепите к наконечнику шприца фильтр 0,45 микрометра.

Добавьте в флакон отфильтрованный набухающий раствор для гидратации липидной пленки. Закройте флакон крышкой и запечатайте флакон пластиковой парафиновой пленкой. Храните флакон при температуре 60 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы получить агрегат GUV.

Охладите пузырьки до комнатной температуры в течение часа после снятия с огня. Отрежьте конец пластикового наконечника для микропипетки объемом 200 микролитров, чтобы заполнитель GUV мог быть втянут в наконечник. С помощью обрезанного наконечника пипетки переложите заполнитель и 50 микролитров набухающего раствора в чистый сухой двухмиллилитровый флакон.

Добавьте во флакон 950 микролитров свежего набухающего раствора или изотонического раствора для достижения симметричных или асимметричных условий раствора соответственно. Подавайте смесь пипеткой вверх и вниз, а затем осторожно переверните флакон несколько раз, чтобы снова суспендировать GUV. Чтобы начать оценку, поместите аликвоту суспензии GUV в силиконовый изолятор на предметное стекло микроскопа.

Запечатайте камеру покровным стеклом. Дайте образцу восстановиться в равновесии в течение пяти минут. Затем поместите предметное стекло на предметный столик флуоресцентного микроскопа и получите изображения не менее 30 GUV за партию.

Изучите изображения, чтобы определить фазовые состояния GUV изображений. GUV в состоянии одной жидкой фазы будут сферическими и гладкими с флуоресцентной меткой, равномерно распределенной по всей мембране. GUV в жидком упорядоченном и неупорядоченном двухфазном состоянии будут сферическими с флуоресцентной меткой, разделенной на домены с гладкими границами внутри мембраны.

Убедитесь, что домены свободно диффундируют на поверхностях везикул и могут коалесцировать. GUV в двухфазном или трехфазном состоянии твердой жидкой фазы будут округлены с некоторыми угловыми границами. Жидкие домены на твердом фоне не должны демонстрировать диффузию, но твердые домены должны свободно диффундировать на жидком фоне.

После того, как фазовое состояние каждого GUV изображения определено, определите доминирующее фазовое состояние для пакета. Повторите процесс с независимыми образцами, если доминирующим фазовым состоянием является незначительное большинство. Перед использованием микрофлюидного устройства приготовьте не менее пяти миллилитров каждого раствора сахарозы и соли для набухания.

Отфильтруйте каждый раствор через фильтр 0,45 микрометра. Затем обрежьте концы пластиковых наконечников для пипеток объемом 200 микролитров и поместите наконечник для пипетки в каждый канал устройства. Добавьте в резервуар устройства 100 микролитров свежего отфильтрованного набухающего раствора того же типа, который используется для приготовления ГУВов.

Добавьте пять микролитров набухающего раствора на каждый наконечник пипетки. Центрифугируйте устройство при 900-кратном G в течение 10 минут, чтобы заполнить каналы устройства. Затем наполните стеклянный шприц объемом в один миллилитр таким же процеженным раствором для набухания.

Подсоедините отрезок трубки к шприцу. Протолкните набухающий раствор через трубку до тех пор, пока поршень полностью не опустится и трубка не будет заполнена раствором. Затем подсоедините трубку к выпускному каналу и установите шприц на шприцевой насос.

Далее подключите блок регулирования давления к входным отверстиям микрофлюидного канала. Убедитесь, что клапаны закрыты, а затем установите давление на три бара. Поместите микрофлюидное устройство на предметный столик инвертированного конфокального микроскопа.

С помощью пипетки удалите набухший раствор из резервуара устройства до тех пор, пока не останется только 25–50 микролитров раствора. Добавьте в резервуар 150 микролитров суспензии GUV и перемешайте суспензию с помощью щадящего пипетирования. Запустите шприцевую помпу в режиме вывода со скоростью 10 микролитров в минуту в течение 20 минут или до тех пор, пока не будет занято более 90% ловушек устройства.

Затем откройте клапаны блока регулирования давления, чтобы закрыть кольцевые клапаны в микрофлюидном устройстве. Остановите шприцевой насос и дайте устройству постоять в течение одного часа, прежде чем получить конфокальные изображения GUV в устройстве. Далее с помощью пипетки удалите суспензию GUV из резервуара, чтобы осталось всего от 25 до 50 микролитров.

Добавьте в резервуар 150 микролитров другого типа отфильтрованного набухающего раствора и аккуратно пипетируйте смесь вверх и вниз. Повторите этот процесс не менее пяти раз, чтобы полностью заменить раствор в резервуаре. Запустите шприцевую помпу в режиме вывода со скоростью 10 микролитров в минуту в течение 10 минут для замены раствора в микроканалах.

Затем уменьшите скорость потока до одного микролитра в минуту. Закройте клапаны блока управления давлением на две секунды, а затем откройте клапаны и остановите шприцевой насос. Дайте устройству постоять в течение одного часа, прежде чем записывать конфокальные изображения.

Чтобы начать подготовку камеры контроля температуры, сначала прикрепите фитинги из колючих труб к алюминиевому узлу теплового потока с окнами покровного стекла толщиной два миллиметра. Прикрепите резиновую прокладку к одному из покровных стекол, чтобы сформировать камеру наблюдения. Загрузите в камеру наблюдения 100 микролитров суспензии GUV и загерметизируйте камеру покровным стеклом.

Медленно переверните сборку. Подключите алюминиевую камеру к внешней водяной бане. Установите сборку на предметный столик для микроскопа.

Установите внешнюю водяную баню на самую низкую желаемую температуру и дайте системе уравновеситься в течение 10-15 минут. Получение изображений GUV и определение фазовых состояний при различных температурах. ГУВ получали из различных соотношений DOPG и яичного сфингомиелина и холестерина в симметричных растворах сахарозы или соли.

Их доминирующие фазовые состояния определяли методом флуоресцентной микроскопии. Затем выбранные композиции переводили в асимметричные условия путем разбавления для оценки эффективных условий раствора по фазовому поведению. Для дальнейшего исследования поведения фазы GUV в асимметричных растворах GUV были захвачены в микрофлюидное устройство, чтобы обеспечить полный обмен внешним раствором.

Захваченные GUV оценивали с помощью конфокальной микроскопии до и после флюидного обмена. Фракция однородных и разделенных по фазам GUV контролировалась в диапазоне температур для оценки эффективного поведения фазы GUV. В данных наблюдалась сигмоидальная структура, которая затем была подогнана к модели Больцмана.

Температура, при которой доля фазоразделенных GUV составляла 0,5, определялась по подогнанной кривой. Хотя эти методы могут дать представление о поведении мембранной фазы, их приложения также могут быть использованы для других экспериментов, таких как изучение взаимодействий между мембранами в биомолекулах в физиологических условиях.