Первичных зародышевых клеток Трансплантация для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-основе скачка в Xenopus

Общая цель метода «липфроггинга» (leapfrogging) заключается в упрощении создания мутантных линий для генов, которые являются жизненно важными для эмбриогенеза. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы генетики развития и других областей науки. Главным преимуществом этой техники является возможность получения мутантов по эссенциальным генам уже в поколении F1.

Для начала этой процедуры проведите микроинъекцию комплексов Cas9-sgRNA в эмбрионы Xenopus на стадии одной клетки, как описано в текстовом протоколе. Когда эмбрионы достигнут возраста 4,5 часа после оплодотворения (ранняя стадия бластулы 9), извлеките их из инкубатора при 25 °C, чтобы они продолжили развитие при комнатной температуре. Чтобы начать трансплантацию через пять часов после оплодотворения, с помощью пипетки Пастера перенесите один неинъецированный эмбрион в 60-миллиметровую чашку с агарозой, содержащую углубления, которая будет служить реципиентом трансплантата.

Также перенесите один эмбрион-донор PGC в чашку. С помощью пинцета вручную удалите желточные оболочки с каждого эмбриона. Поверните оба эмбриона так, чтобы их вегетативные полюса были видны и доступны для проведения операции.

Затем, стабилизировав эмбрион-реципиент с помощью волосяной петли, введите острый кончик ножа из волоска брови в вегетативный полюс, чуть ниже поверхности. Быстрыми режущими движениями вверх сделайте четыре неглубоких надреза в форме квадрата внутри зоны, где в будущем образуются бутылочные клетки, отмечающие бластопор. После того как четыре стороны квадрата будут очерчены, с помощью ножа из волоска брови углубите каждый надрез аналогичными режущими движениями до глубины примерно 1/3–1/2 расстояния до дна бластоцеля.

Отделите эксплантат вегетативной ткани от эмбриона-реципиента, сделав один или несколько горизонтальных разрезов в глубокой вегетативной области. Затем, действуя быстро, повторите эту процедуру на эмбрионе-доноре ПСК, чтобы создать фрагмент вегетативной ткани аналогичного размера для трансплантации. После извлечения ткани, содержащей ПСК, из эмбриона-донора, с помощью ножа из волоска брови и петли из волоска поместите эксплантат в отверстие, созданное в эмбрионе-реципиенте.

С помощью стержня ножа для стрижки бровей, удерживаемого параллельно поверхности трансплантата, осторожно вдавите трансплантат в отверстие на вегетативной поверхности эмбриона-реципиента. Используя петлю для волос, аккуратно переместите тело эмбриона-донора по поверхности агарозы в лунку. Убедитесь, что открытая рана тела обращена к объему жидкости.

Переместите эмбрион-реципиент в соседнюю лунку, также убедившись, что трансплантированная ткань вегетативного полюса обращена к объему жидкости. Повторите трансплантацию PGCs с дополнительными эмбрионами для создания большего количества пар «донор-реципиент», пока эмбрионы не достигнут примерно 10-й стадии (ранняя гаструла), перенося эмбрионы в пустые лунки по мере проведения трансплантации. После того как трансплантаты приживутся, что обычно происходит через 30–45 минут после операции, с помощью пастеровской пипетки очень осторожно перенесите эмбрионы из углублений в отдельные лунки 24-луночного планшета с агарозным покрытием.

Поверните эмбрионы так, чтобы их вегетативный полюс был направлен вверх, в сторону основного раствора. Поместите донорские тела и реципиентов трансплантата в соседние лунки, чтобы облегчить отслеживание пар эмбрионов, и зафиксируйте эти данные. Затем перенесите 24-луночный планшет с эмбрионами в инкубатор при температуре 25 °C на ночь.

На следующий день перенесите каждого реципиента трансплантата, находящегося на ранней стадии формирования хвостового бугорка, в отдельную лунку нового шестилуночного планшета с агарозным покрытием. Вырастите эмбрионы, полученные методом «leapfrogging», и проведите анализ донорской ДНК, выделенной из тушек, согласно текстовому протоколу. Поскольку метод «leapfrogging» позволяет получить животных с эффективной заменой зародышевой линии мутантными аллелями, мутантные фенотипы могут быть получены уже в поколении F1.

Как представлено в этой таблице, Blitz и соавт. сообщили, что у большинства животных поколения F0 с воздействием на локус тирозиназы, необходимый для пигментации меланоцитов и сетчатки, наблюдается 100%-ная передача мутантных геномов донора в зародышевой линии, что было определено путем скрещивания с альбиносами, имеющими делецию гена tyr. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить трансплантацию первичных половых клеток Xenopus.